VO 7 Genetik

• Sequenzbestimmung von Insulin: Protein
• Sequenzbestimmung von tRNA: 3 Jahre, 5 Forscher, 1g tRNA von 140kg Hefe... .75 Nukleotide
• Fremde DNA kann in bakterielle Plasmide eingebracht und dort vermehrt werden
• Gene Manipulation kann mittels CRISPR/Cas9 erfolgen.
• Reverse Genetik kann auch mittels RNA-Interferenz (RNAi) durchgeführt werden.
• Wenn die transgenen Zellen zur Keimbahn beitragen, kann eine heterozygote Maus entstehen, die anschließend homozygotisiert wird.
• Genbanken: Genomische DNA wird mit Restriktionsenzymen partiell verdaut und in einen Vektor (Plasmid, Bakteriophage Lambda, Cosmid) kloniert
• Der Einbau eines didesoxy-Nukleotids führt zum Strangabbruch
• Didesoxy-Nukleotide sind mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert
• Gelelektrophorese in Acrylamid Kapillaren und Abtasten der Signale mit einem Laser, erlaubt die Sequenzbestimmung
• Sanger Sequenzierung, Kettenabbruchverfahren
• Shotgun sequencing - Überlappen von zufälligen Klonen
• Pyrosequencing: NGS method with the advantage of sequencing millions of sequences simultaneously, but with the disadvantage of producing short sequences and being expensive per run.
• Illumina Sequencing: NGS method that has significantly reduced sequencing costs and allows for the generation of long sequences.
• Prenatal Tests (NIPT): Noninvasive prenatal testing that allows for noninvasive diagnosis of genetic conditions in fetuses.
• Microarrays: Used to identify SNP variations by hybridizing marked sequences to oligonucleotides that cover the entire genome.
• SNPs (Single nucleotide polymorphisms): Genetic variations in genomes that can be used to identify correlations with specific traits and complex inheritance patterns.
• SNP Variation in Isolated Populations: Can be used to identify genetic risk factors and predispositions in specific populations.
• Precision Medicine: Individualized medical treatments based on the specific genetic mutations present in a patient.
• cDNA Banks: mRNA is purified using oligo dT columns and reverse transcriptase is used to synthesize cDNA, followed by DNA polymerase to generate the second DNA strand.
• Next Generation Sequencing (NGS): Alternative to electrophoretic sequencing, allows for in vitro amplification of DNA fragments and measurement of biochemical reactions of nucleotide incorporation.
• Erste Genome, die sequenziert wurden: Haemophilus influenza (2 Mb, 1995), Cerevisiae (2 Mb, 1996), C. Elegans (100Mb, 1998)
• Weiter Fortschritte in der Softwareentwicklung, um Sequenzen zu "assemblieren"
• Reverse Genetik erlaubt die Analyse von Gen-Funktionen aufgrund spezifischer Inhibition eines bestimmten Genes.
• Isolation eines bestimmten Gens mittels Polymerase Chain Reaction (PCR).
• Bioinformatische Vergleiche erlauben die funktionelle Zuordnung vieler Gene.
• Mehr als 60% aller S. cerevisiae Gene können eine Funktion aufgrund bioinformatischer Ähnlichkeiten zugeordnet werden.
• Die erfolgreiche Insertion des Konstrukts wird wieder mittels PCR überprüft.
• Komplett sequenzierte Genome erlauben die Identifikation homologer Gene mittels Bioinformatik.
• Das Gen, welches mittels PCR amplifiziert wurde, wird in einen Vektor kloniert und kann mit einem Resistenzgen zerstört werden. Das resultierende Konstrukt kann mittels homologer Rekombination das endogene Gen zerstören.
• Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung der PCR war die Isolierung von thermostabilen DNA-Polymerasen, welche in Thermophilen Prokaryoten gefunden wurden.
• Isolation von homologen Genen mittels Komplementation: Hefe DNA wird in einen Expressionsvektor kloniert und in S. cervisiae Zellen transformiert, welche KEIN Arginin synthetisieren können. Nur Zellen, welche das fehlende Gen am Plasmid enthalten, können wieder wachsen und Kolonien bilden.
• Die Isländische Firma DeCode Genetics hat Stammbäume aller Isländer und deren Krankengeschichte zur Identifikation von Risikofaktoren verwendet und genetische Tests hierfür vermarktet.
• Um rekombinante Mäuse zu generieren, wird das Zielgen in embryonalen Stammzellen (ES) Zellen durch homologe Rekombination zerstört. Rekombinante ES Zellen werden in Blastozysten injiziert, wo diese zum sich entwickelnden Embryo beitragen. Die Blastozysten werden in scheinschwanger Mäuse injiziert.