Scheidingsmechanismen

• SEC scheidt moleculen (met een grote molecuulmassa) op grootte. De pakking voor size exclusion chromatografie bestaat uit kleine (~10 micrometer) silica- of polymeerdeeltjes die een netwerk van poriën bevatten waar componenten door middel van diffusie in kunnen worden vertraagd. Met behulp van deze moleculaire zeef kunnen moleculen tijdens een chromatografische scheiding op grootte worden geselecteerd.
• Gelfiltratie chromatografie scheidt op grootte. 


  De kolom is een gel bestaande uit - met poriën bedekte- korreltjes. De moleculen van de mobiele fase 'vallen' in de poriën. De poriën en korrels hebben een voorgeschreven diameter. Grotere eiwitten zullen niet in de poriën passen, en dus de kortste weg nemen langs de korreltjes. De grootste eiwitten zullen dus in het 'void volume' terechtkomen, en dus als eerste elueren. Hoe kleiner de eiwitten, hoe vaker ze in de poriën zullen vallen, en hoe langer ze er over zullen doen om de onderkant van de kolom te bereiken.
• SDS-PAGE scheidt op grootte.


  Staat voor natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide gel electroforese. Hydrogel is van polyacrylamide. De gel wordt geladen met een eiwit sample dat is gedenatureerd, o.a. met mercaptoethanol dat S-bruggen verbreekt. SDS wordt gebruikt om het eiwit te binden (1 SDS per twee aminozuren); door de negatieve kopgroep is de ladingsdichtheid van alle eiwit-SDS complexen vrijwel gelijk. Hierdoor kunnen de eiwitten op grootte worden gescheiden, door ze op de gel te brengen en te laten migreren onder invloed van spanning. Hoe kleiner het eiwit, hoe verder het elueert.
• Dialyse scheidt op grootte.

  Eiwitten kunnen worden gescheiden van kleine moleculen zoals zout door dialyse door een semi permeabel membraan zoals een cellulose membraan met poriën. De eiwit mix wordt in de dialyse tas gestopt, waarna deze wordt ondergedompeld in een buffer oplossing die geen kleine moleculen bevat. De moleculen die grotere dimensies hebben dan de porie diameter blijven dus in de dialyse zak. De kleinere moleculen en ionen die door de poriën heen kunnen diffuseren ‘down there’ concentratie gradiënten en gaan naar de oplossing buiten de zak.
• 2D-elektroforese scheidt op grootte en PI

  Het verticale deel is SDS-PAGE en het horizontale deel is Iso-elektrisch focusseren
• Ion wisselingschromatografie scheidt op lading

  De kolom van een IEC is sterk polair. Er bestaan twee typen IEC; een kationenwisselaar en een anionenwisselaar. Een kationwisselaar bestaat zelf uit negatief geladen sulfonzuurresten (-C2-H4- SO3-). Een anionwisselaar bestaat zelf uit quaternaire ammioniumgroepen. (-C2-H4-N+-(ethyl)3) \ Als men nu langzaam de zoutconcentratie verhoogd, kan het gebonden eiwit aan de geladen groepen in de kolom gescheiden worden. Dus bij kationwisselaar: zullen de negatief geladen deeltjes eerder passeren.
• Iso- elektrisch focusseren scheidt op PI(=Iso-elektrisch punt)

  Bij deze pH is de elektroforetische mobiliteit nul omdat ze in de vergelijking (1*) nul is. Een pH-gradiënt bepaalt het gedrag van de eiwitten; de zure residuen worden negatief geladen in een basisch milieu (en omgekeerd). De eiwitten, die een verzameling zijn van basische en zure residuen, zullen migreren tot ze bij de pH-zone (overeenkomstig hun pI) terechtkomen waar hun netto-lading nul wordt.
• Uitzouten scheidt op oplosbaarheid


  De meeste eiwitten zijn minder oplosbaar tijdens hoge zout concentraties. Dit effect heet ‘uitzouten’. Bij welke zout concentratie het eiwit zal neerslaan verschilt per eiwit. Dus kan het gebruikt worden om de eiwitten op te splitsen .
• Affiniteitschromatografie scheidt op aantrekkingskracht tot x


  Het kan effectief worden gebruikt om een eiwit te isoleren dat een groep X herkent door : (1) covalente bindingen of een derivaat aan een kolom; (2) het toevoegen van een mix van eiwitten aan deze kolom, welke daarna wordt gespoeld met een buffer om de ongebonden eiwitten te verwijderen; (3) het scheiden van het geliefde eiwit door een hoge concentratie van de oplosbare vorm van X toe te voegen of de condities te veranderen om de bindingskracht te verkleinen.
• ELISA scheidt op aantrekking tot x 


  (enzyme linked immuno sorbent assay): je toont een bepaald eiwit aan met een enzym. Begin met een antigen te immobiliseren van het antilichaam waarvan je wilt aantonen dat het aanwezig is dit doe je in een kleurloze vloeistof Voeg assay, antilichaam dat je wilt aantonen, toe (gaat op de bodem zitten) Voeg enzyme-linked antilichaam toe die het F-C fragment herkend Voeg substraat enzym toe er ontstaat fotochemische reactie waardoor je kan zien of het eerste antilichaam dus aanwezig is omdat de vloeistof nu kleur

  krijgt.
• Western blotting: SDS-PAGE van eiwitten Eiwitten overbrengen op polymeer vel Breng het vel met de eiwitten in contact met het primaire antilichaam (antilichaam specifiek voor het eiwit wat je onderzoekt) Het anitlichaam-antigeen complex kan nu gedetecteerd worden door een secundaire antilichaam (specifiek voor het primaire antilichaam) toe te voegen Op een autoradiagram (foto gevoelige plaat) ontstaat een zwarting op de plek van het eiwit dat heeft gereageerd met het antilichaam.
• Types ELISA zijn:

  Direct: Detecteert specifiek eiwit met 1 antilichaam galabeld met een enzym.

  Indirect: Gebruikt 2 antilichamen, de eerste bindt aan het doelmolecuul, de tweede aan de eerste en is gelabeld met een enzym.

  Competitieve: Meet competitie tussen gelabeld en ongelabeld eiwit voor binding aan het vaste oppervlak, de hoeveelheid gebonden gelabeld is omgekeerd evenredig met de concentratie van het doelmolecuul.

  Sandwich: Detecteert eiwit tussen twee antilichamen. Beide antilichamen binden aan het doelmolecuul en de tweede is gelabeld.