MolBio 1

• Genomgrößen verschiedener Organismen:

  Bakterium (E.coli)= 4,6Mio Basenpaare und 4300 Gene.

  Mensch= 3,2Mrd Basenpaare und 21000 Gene.

  Pflanze= 150Mrd Basenpaare und ? Gene.
• Genomgröße vs Anzahl Gene:

  1 Gen pro 1000 Basenpaare.
• Ca. 1,5% des menschlichen Genoms codiert für Proteine
• Vorstufen der Biomoleküle: Wasser (H2O), Kohlenstoffdioxid (CO2), Ammonium (NH4+), Nitrat (NO3-), Stickstoff (N2), Phosphat (HPO4(2-)), Schwefel oder Sulfat (SO4(2-))
• Bausteine des Lebens sind Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Thymin (T) und Uracil (U).
• Nichtkovalente Bindungen:

  1. elektrostatisch
  2. Wasserstoffbrücken
  3. Van-der-Waals-Wechselwirkung
  4. Hydrophobe-Wechselwirkung
• Kovalente Bindungen:

  1. Elektronenpaarteilung
  2. Bindungslänge 1,54 Å
  3. Bindungsenergie hängt von der Größe der Bindungspartner und deren Bindungslänge ab.
  4. Je größer der Bindungspartner, desto größer der Radius, desto geringer die Bindungsenergie.
• Geladene Seitenketten sind:

  1. Aspartat (Asp/D)
  2. Glutamat (Glu/E)
  3. Lysin (Lys/K)
  4. Arginin (Arg/R)
• Hydrophile Seitenketten:

  1. Cystein (Cys,C)
  2. Asparagin (Asn,N)
  3. Glutamin (Gln/Q)
  4. Serin (Ser,S)
  5. Threonin (The,T)
  6. Tyrosin (Tyr,Y)
• Hydrophobe Seitenketten:

  1. Glycin (Gly,G)
  2. Alanin (Ala,A)
  3. Prolin (Pro,P)
  4. Isoleucin (Ille,I)
  5. Methionin (Met,M)
  6. Valin (Val,V)
  7. Leucin (Leu,L)
  8. Tryptophan (Trp,W)
  9. Phenylalanin (Phe,F)
• Beta-Faltblatt

  Ganghöhe: 3,37 -Å für antiparallel und 3,25Å für parallel.

  Antiparallel: NH und CO-Gruppen verbinden jede Aminosäure mit einer anderen.

  Parallel: Wasserstoffbrücken verbinden jede Aminosäure mit zwei anderen.
• Tautomere Formen können Mutationen hervorufen. Tautomere Formen bestimmen über die Oberfläche der großen Furche (Amino-Cytosin und Keto-Guanin).
• bDNA:

  1. Rechtsgängig
  2. dominante Struktur für DNA
  3. 10 Basenpaare pro Windung
• aDNA:

  1. Rechtsgängig
  2. tiefe große Furche
  3. breite kleine Furche
  4. dominante Struktur für RNA
  5. 11 Basenpaare pro Windung
• zDNA:

  1. Linksgängig
  2. 12 Basenpaare pro Windung
  3. zDNA bildet sich bei hoher Salzkonzentration
• DNA-Replikation benötigt:

  • DNA Polymerase
  • Templat
  • Primer
  • dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • Mg2+ Ionen
• DNA-Polymerase kann im Prinzip an jeder Stelle der DNA eine Replikation durchführen, solange 3'-OH als Anfangspunkt für Primer vorhanden sind.
• DNA vs RNA:

  Ähnlichkeiten:

  1. Synthese läuft in 5' ->3' Richtung
  2. Verlängerungsmechanismus ist gleich
  3. Synthese durch Hydrolyse und Pyrophosphat angetrieben.

  Unterschiede:

  1. RNA-Polymerase benötigt keinen Primer.
  2. RNA-Polymerase hat eine geringere Fehlerkorrektur.
• DNA wird mittels Restriktionsenzymen geschnitten. Die geschnittenen Reste werden dann mittels der Gelektrophorese nach Größe getrennt und die Banden eingefärbt. So sind sie unter UV Licht sichtbar.
• Welche Restriktions-Erkennungssequenzen sind bekannt?

  Die bekannten Sequenzen heißen Palindrome. Jedes Restriktionsenzym hat eine eigene Sequenz, an die es die DNA schneidet.
• Welche Restriktionsenzyme sind von Bedeutung?

  1. Sac2
  2. BamH1
  3. EcoR1
  4. EcoR5
• Wie sorgt E.coli dafür, dass die eigene DNA nicht geschnitten wird?

  Eine Methylgruppe wird am ende der 5' Erkennungssequenz an die Aminogruppe (N6) des Adenin Nukleotids angefügt. Dies geschieht durch Methylase / Methyltransferase.
• Welche Unterschiede gibt es zwischen bakterieller (prokaryotisch) und eukayrotischer RNAP2?

  RNAP2 in Eukaryoten:

  • synthetisiert prä-RNA, welches zusätzlich prozessiert werden muss.
  • synthetisiert die RNA im Zellkern.
  • bildet 5' Cap-Strukturen und 3' poly-A an der mRNA.
  • Cap-Strukturen werden direkt nach der Initiation eingefügt, RNA wird gespleißt und / oder editiert noch während der mRNA-Synthese.
• Promotor der eukaryotischen RNAP2.

  Enhancer -> TATA-Box -> lnr

  oder

  Ehancer -> lnr -> DPE
• Aus welchen Bestandteilen besteht der RNAP2 Elongationskomplex?

  • Wand (Wall)
  • Klammer (Clamp)
  • Brücke (Bridge-Helix)
  • Mg(2+)
  • (DNA)
  • Pore
• Welche Aufgabe erfüllt die Klammer (Clamp)?

  Die Klammer hält die DNA fest und fixiert diese im Spalt.
• Wofür ist die Bridge-Helix zuständig?

  Die Bridge-Helix (Brücke) schiebt die neu gepaarten Nukleotide von +1 nach -1.
• Wie werden NTP's über dNTP's selektiert?

  Der "Trigger-Loop" in der Rpb1 Untereinheit selektiert NTP über dNTP.
• Was bewirkt did Rekrutierung von Elongationsfaktoren?

  Die Phosphorylierung der C-Terminalen Dömäne (CTD) der RNAP2 bewirkt die Rekrutierung.
• Mechanismus der Restriktionsenzym-Analyse (Cloning)

  1. Spaltung über EcoR1
  2. Anlagerung der Fragmente und Verknüpfung durch DNA-Ligase (Die Verknüpfung wird katalysiert durch eine DNA-Ligase. Dies geschieht unter ATP oder NAD verbrauch).
• Sequenz der TATA-Box

  5' TATA(AAA) 3'
• Sequenz der CAAT-Box

  5' (GGN)CAAT(CT) 3'
• Sequenz der GC-Box

  5' (GG)GC(GG) 3'
• ß-Faltblatt.

  Das β-Faltblatt ist zusammengestellt aus β-Stränge. Die Stränge im β-Faltblatt können parallel oder antiparallel angeordnet sein,

  Ganghöhe pro Rest:

  • 3.47 Å für antiparallele Stränge

  • 3.25 Å für parallele Stränge

  Jeder Strang eines β-Faltblattes ist in Prinzip eine Helix mit zwei Reste pro Umdrehung.
• Wichtigste Punkte zur B-DNA.

  • Antiparallele Anordnung
  • Basenabstand 3,4 Å führt zur Basenstapelung und vdW.-WW.
  • Zucker/Phosphate nach außen gerichtet, Basen nach innen.
  • Ganghöhe ca. 34 Å, d.h. ca. 10 Basenopaare pro Windung.
  • Drehwinkel pro Base 36°.
  • Durchmesser der B-DNA ist ca. 20 Å.
  • Die B-DNA enthält zwei Furchen, eine große und eine kleine Furche.
  • Akzeptor/Donor-Landschaft erlaubt Unterscheidung zwischen A-T und T-A.
• Die RNAP initiiert die Transkription ohne einen Primer.

  • Das erste Ribonukleotid des neuen RNA-Strands muss in das aktive Zentrum gelangen und solange mit dem DNA-Matrizenstrang assoziieren, bis das zweite Nukleotid-Triphosphat das aktive Zentrum erreicht hat.
  • Besonders schwierig, da die meisten Transkripte mit (A) beginnen, und somit nur zwei H-Brücken.
  • Für eine stabile Wechselwirkung zwischen Holoenzym und DNA/RNA-Nukleotid sind verschiedene Bereiche der RNAP zuständig. (z.B. σ3/4-Linker).
  • RNAP synthetisiert am Anfang kurze RNA-Fragmente (< 10 nt) die freigelassen werden (abortive Synthese).
• Sigmafaktoren für E.coli.

  • Standardpromotor (TTGACA)-(TATAAT)
  • Hitzeschockpromotor
  • Stickstoffmangelpromotor
• Die Polymerasen

  • DNAP1 hat > 95 % aller Polymerase Aktivität in der Zelle. Polymerase 1 macht "Nick-Translation" (5' -> 3' Exonuclease Aktivität und ist involviert in DNA Reparatur.
  • DNAP2 funktioniert in der DNA Reparatur (zusammen mit Pol4 und Pol5).
  • DNAP3 ist die E.coli Replicase (chromosomale Replikation).
  • DNAP3 ist fast wie DNAP1, hat aber keine (5' -> 3' Exonuclease Aktivität) und ist viel schneller.
• 3' -> 5' Exonuclease Aktivität

  (3' -> 5') Exonuclease Aktivität ist die proof-reading d.h. die Korrekturlesefunktion der Polymerasen. Diese setzt ein, wenn eine falsche (nicht-komplementäre) dNMP eingebaut worden ist. Die Polymerasen I, II, und III haben, wie viele (aber nicht alle) Polymerasen, diese Eigenschaft.
• 5' -> 3' Exonuclease Aktivität


  Die (5' -> 3') Exonuclease Aktivität macht "Nick-Translation".