purif

• Pour purifier de l’ADN génomique, la contamination par des acides nucléiques, ou des protéines est possible (souvent).
• Les acides nucléiques sont chargés négativement, on a joué dessus pour les récupérer, mais les ribosomes (d’autres acides nucléiques) tombent aussi et contaminent l’ADN génomique que l’on veut récupérer.
• La purification des protéines est très compliquée car toutes les protéines sont différentes.
• On purifie les biomolécules pour en faire l’étude fondamentale et l’utiliser par la suite, comme dans le cas du génie génétique où on insert de l’ADN dans un plasmide et fait une purification.
• Purification = débarrasser de ses impuretés.
• Quand on fait du génie génétique, on insert de l’ADN dans un plasmide, et là aussi on fait une purification, mais ce type de purification marche en kit.
• Pour une protéine, c’est différent, la structure primaire n’est pas fragile mais la structure tertiaire l’est donc on doit s’adapter au cas par cas car on veut conserver l’activité de la protéine.
• On essaye de collecter un maximum d’informations sur l’objet d’étude car on ne procède pas de la même manière selon que l’on cherche à extraire un lipide, un acide nucléique, un métabolite, …
• La polarité du solvant est importante, selon la polarité du solvant et les possibilités de liaisons hydrogènes, un solvant peut être soluble dans un autre solvant.
• La constante diélectrique donne une idée de la polarité du solvant.
• L’addition d’éthanol modifie la constante diélectrique du milieu, quand le solvant est moins polaire que l’ADN, l’ADN précipite.
• La précipitation est une réduction de volume de surface exposée au solvant, de façon à ce que ce soit le plus acceptable possible.
• Pour obtenir une protéine recombinante, on construit un promoteur inductible, on contraint la bactérie à produire la protéine d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur fort, on attend qu'il y en ait assez pour avoir une surproduction.
• Les protéines endogènes ou produits naturels peuvent être extraites directement d'un organisme (homologue) qui les a produites.
• Les protéines endogènes sont généralement non modifiées.
• Pour obtenir une protéine, on prélève les tissus de l'organisme, puis on extrait la protéine, puis on la purifie, et enfin on a la protéine pure.
• Pour étudier les protéines endogènes, il est nécessaire de travailler sur des organismes plus gros.
• Pour obtenir une protéine, on ciblera l'organe dans lequel elle est produite, puis le type cellulaire, puis l'organite dans lequel on a la protéine.
• Pour obtenir une protéine recombinante, on cherche un gène d'intérêt dans la banque d'ADN, puis on l'insère dans un plasmide.
• La croissance bactérienne devient assez vite exponentielle, on arrive à avoir beaucoup de bactéries qui ont le plasmide.
• Plus la constante dielectrique est élevé plus le solvant est polaire et plus les charges seront diluées.
• Les inconvénients de l'extraction de protéines recombinantes sont l'accumulation de la protéine d'intérêt et l'accumulation de matériel.
• Les protéines recombinantes permettent la réalisation d'une mutagénèse dirigée.
• Le but de l'extraction de la protéine est d'obtenir celle-ci dans son état natif.
• Les protéines recombinantes sont obtenues en génie génétique, grâce à un plasmide, qui est une boite à outils pour l'expression du gène.
• Les inconvénients de l'extraction de protéines endogènes sont la quantité faible et le matériel consommé.
• La maturation post traductionnelle inhomogène (les chaînes sont plus ou moins courtes etc.) rend difficile l'étude en structure inhomogène.
• L’eau est le solvant du vivant, il y a un moment dipolaire décrit par la loi de Coulomb dont l’énergie s’écrit : 1/4 x pi x e0 x eR xq/R
• Protéases à serine peuvent subir des mutations ponctuelles au niveau des 3 acides aminés du site actif, permettant de mieux comprendre la fonction de la protéine et l'optimiser.
• Pour comprendre l'influence d'une tyrosine dans un site catalytique, on a le gène avec le codon TAT (tyrosine) et on modifie TTT donc on en fait une Phénylalanine qui lui ressemble mais qui est apolaire.
• L'avantage principal de cette méthode est l'obtention de quantités importantes de la protéine d'intérêt.
• Si on veut faire traduire une protéine humaine à une bactérie, on peut faire un gène optimal pour qu'il n'y ait pas de frein lors de la transcription ou traduction.
• Dans les années 80, certains enfants grandissaient plus vite que les autres car on leur donnait de l'hormone de croissance (produite dans l'hypophyse).
• L'avantage de cette méthode est le problème de santé publique réglé.
• On peut modifier la séquence de la protéine grâce au génie génétique et l'intérioriser dans un vecteur dans un hôte facilement manipulable (cellules d'insecte, œufs de crapauds, bactéries).
• L'inconvénient de cette méthode est qu'on doit disposer de la séquence du gène, on n'a pas le même fonctionnement que les procaryotes.
• Pour synthétiser une protéine recombinante, il est impossible car on ne partage pas les mêmes virus que les bactéries.
• Le code génétique est beau universel, mais en fonction de l'organisme, la représentation des ARNt n'est pas homogène, il existe des codons rares dans un organisme donné par rapport à un organisme de départ.
• On réalise la mutation et on exprime le gène modifié dans E.coli.
• La polarité rendait la protéine active, ici on a perdu la propriété de la protéine donc on sait comment marchait la protéine.