Gentechnik

• Probleme der konventionellen Klonierung

  Vektor Re-ligation --> Vektor dephosphorylieren

  2 mögliche Orientierungen des Gens --> gerichtete Ligation mit 2 verschiedenen Enden

  Manche Inserts sind "resistent" zum Klonieren
• Welche Probleme können bei Arbeiten mit Ethidium Bromid auftreten?

  Hohe Anzahl an Hintergrundsignalen, weil EtBr am Zucker-Phosphat-Rückgrat bindet
• Nenne eine DNA-Polymerase mit proofreading-Aktivität

  Pfu-Polymerase

  proofreading

  teuer

  langsam

  blunt ends
• Nenne Vor- und Nachteile der Gateway Klonierung

  Vorteile

  keine Restriktionsenzyme benötigt

  keine Ligation nötig

  RealTime-Reaktion mit >99% Effizienz

  1h Reaktionszeit

  reversibel

  Nachteile

  LR-Reaktion funktioniert manchmal nicht

  teuer
• Erkläre die Gateway-Klonierung

  1. Gen wird via PCR mit attB-sites versehen, werden vom Primer getragen
  2. Erzeugung Entry Clon

  BP-Clonase Reaktion

  cddB gen (attP-sites) auf Vektor wird mit PCR-Produkt ausgetauscht

  attB1 reagiert mit attP1 & attB2 mit attP2 --> Entry Clon generiert attL-Sequenz

  Nebenprodukt: cddB gen mit attR-sites

  
  

  3. Expressionsvektor erzeugen

  LR-Reaktion

  LR-Cloanse generiert attB-sites am Expressionsvektor durch reaktion von attL1 & attR1 und attL2 & attR2

  Ziel-Vektor trägt anderes Antibiotheka-Resistenzgen als Entry Clon (cddB)

  
  

  Nebenprodukt: Plasmid mit cddB gen
• Erkläre die Transfektion mit Lipofektin

  synthetische, kationische Lipide erschaffen künstliche Membran (Liposom)

  negative DNA bindet am positiven Liposom & formt ein Lipoplex

  Lipoplex fusioniert mit Zellmembran wodurch ein Endosom entsteht

  DNA wird freigesetzt und in den Nukleus transferiert
• Erkläre die Blau-Weiß-Selektion

  LacZ gen produziert blaue Farbe durch Metabolisierung von X-Galaktose

  Rekombinant erschaffene Bakterien fehlt das LacZ Gen --> weiße Farbe

  original Plasmid hat LacZ Gen --> blaue Farbe
• Erkläre die Durchführung eines Western Blots

  primäre Antikörper binden am Ziel-Protein

  Sekundäre Antikörper sind fluoreszenzmarkiert und binden an primären Antikörper wodurch ein Lichtsignal entsteht

  Signal kann mittels eines chemilumineszenz Kit erfasst werden
• Was gibt der Tm-Wert an?

  Halbwertszeit --> Wann 50% der ds-DNA denaturiert

  (verändert sich mit GC-Konzentration in der DNA)
• Womit können Nukleinsäure-Präparate kontaminiert sein? Wie kann eine Kontamination vorgebeugt werden?

  DNase --> autoklavieren, Handschuhe tragen

  RNase --> autoklavieren, aerosol-barriere Pipettenspitzen nutzen, Handschuhe tragen
• Erkläre die 2D GEP

  1. Dimension: Proteine werden mittel eines elektrischen Feldes entsprechend ihres Pi-Wertes separiert
  2. Dimension: Größenaufteilung mittels SDS

  Für 2D Analyse radioaktiv-markierter Poliovirusproteine
• Erkläre die SDS-Page

  1. Proteine werden mit SDS Detergent inkubiert --> denaturieren und nehmen negative Ladung an
  2. Proteine migrieren im Gel zur positiven Anode
  3. Banden werden mittels Comassie-Brilliant-Blue sichtbar gemacht
• Nenne 5 Bestandteile beim Primerdesign

  Schmelztemp. zwischen 60-75°C

  Fähigkeit zur Primerdimerisierung fehlt

  GC Clamp

  geringe Bindungsstabilität am 3' Ende

  Mangel an secondary binding sites
• Was ist ein dNTP?

  Ein Säureanhydrid das über ein Ester an einen Zucker der C1 Base gebunden ist
• Nenne 4 DNA-modifizierende Enzyme und deren Aufgaben.

  T4 DNA Ligase: repariert Strangbrüche unter ATP-Verbrauch

  Alkaline Phosphatase: entfernt das 5' Phosphat & verhindert damit die Ausbildung neuer Phosphordiesterbindungen durch die DNA-Ligase

  T4 Polynukleotid Kinase: katalysiert Phosphattransfer vom ATP ans 5' OH Ende

  T4 DNA-Polymerase: katalysiert 5'->3' Synthese
• Was versteht man unter Klonierung?

  Erschaffung eines Klons nach Transformation des rekombinanten Plasmids in ein Bakterium & die Isolation einer Bakterienkolonie deren Bakterien alle dieses Plasmid enthalten
• Welche Probleme können beim Restriktionsverdau auftreten? Wie kann man diese Lösen?

  DNA kann methyliert sein, wodurch Enzyme nicht schneiden

  Lösung:

  Anderes Restriktionsenzym verwenden

  Plasmid in E.coli Stamm vermehren dem die Methylase fehlt
• Was muss beachtet werden, wenn Klonierung und Religation in einem Vektor stattfinden?

  Vektor muss dephosphoryliert sein

  Plasmid benötigt "Nicks" (SS-Brüche) zum religieren
• Welche Nukleinsäure-Sequenz ist im Menschen zu finden?

  Kozak-Sequenz
• Welcher Organismus hat eine Shine-Dalgarno-Sequenz?

  E.coli
• Definiere: konventionelle Klonierung

  Erzeugung einer unveränderten Nukleinsäure-Sequenz durch Einligieren eines DNA-Fragments in ein Plasmid
• Nenne eine DNA-Polymerase ohne proofreading-Aktivität


  Taq Polymerase

  keine proofreading Aktivität

  schnell

  effizient

  3'-Überhänge mit Adenin
• In welche Richtung verläuft die Transkription? Benötigt sie einen Primer? Wo findet sie statt?

  5' -> 3' Richtung

  braucht keinen primer, aber einen Promoter auf DNA Ebene

  findet im Zellkern statt
• DNA-Konzentration berechnen bei OD260 = 0,1 und 1:100 Verdünnung

  1 OD = 50ug/ml

  0,1 OD = 5ug/ml * 100 --> 500ug/ml
• Ein Plasmid ist 3kb groß. Welche banden sind supercoiled, circulär und lineare DNA?

  obere Bande: sc

  mittlere Bande: linear (kann auch senkrecht durch Pore nicht nur waagerecht drüber liegen)

  untere Bande: circulär
• Nenne verschiedene Restriktionsenzymtypen und deren Aufgabe.

  Typ1: schneidet weit von Erkennungssequenz entfernt unter ATP-Verbrauch und transferiert Methylgruppe auf DNA

  Typ2: erkennen spezifische DNA-Sequenz und schneiden an konstanter Region, benötigen Mg2+ als Cofaktor

  Typ3: schneiden 20-25bp entfernt von Erkennungssequenz
• Was ist eine Peptidbindung?

  eine Säureanhydridbindung zwischen einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe zweier Aminosäuren
• Was versteht man unter Codon usage?

  Codon usage ist verschieden zwischen verschiedenen Organismen
• Was besagt der genetische Code?

  Es gibt 64 Triplettvariationen bestehend aus 20 Aminosäuren und 3 Stop-codon
• Welche Enzyme sind für die DNA-Replikation wichtig?

  Helikase

  Primase

  Topoisomerase

  DNA-Polymerase 1&2

  DNA-Ligase
• Welches Modell haben Watson&Crick entwickelt? Welche Aussagen haben sie getroffen?

  Doppelhelixmodell

  DNA ist rechtswindig

  10bp pro Windung

  große und kleine Lücken

  Stränge sind antiparallel

  Zucker-Phosphat-Rückgrat

  Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Basen
• Welches Nebenprodukt entsteht beim 2. Schritt der Gateway-Klonierung?

  cddb gen mit attR-sites