Cycle cellulaire et mitose

• La BrdU est un analogue synthétique de la thymidine et non pas de l’adénosine. Tout comme la thymidine, elle est complémentaire à l’adénosine et peut être intégrée dans l’ADN cellulaire pendant la réplication.
• La BrdU qui se trouve dans le milieu peut s’intégrer dans l’ADN des cellules pendant la réplication au cours de la phase S du cycle cellulaire.
• Seules les cellules qui subissent la division cellulaire vont réaliser la réplication et pouvoir intégrer la BrdU. Cela permet de marquer in vivo des tissus et des organes en cours de renouvellement, car leurs cellules vont se diviser activement
• La BrdU est à ne pas confondre avec les colorants de l’ADN (ex. acridine orange) utilisés dans la technique de cytofluorométrie en flux. Pour révéler la présence de la BrdU dans les cellules on utilise des anticorps anti-BrdU couplés à une molécule fluorescente.
• La BrdU permet de déterminer les différentes phases du cycle cellulaire, ce qui permet de calculer l’index mitotique
• l’index mitotique = nombre de cellules en mitose / nombre total de cellules dans l’échantillon)
• Le contrôle du cycle cellulaire dépend de facteurs intracellulaires et de facteurs extracellulaires (= facteurs de croissance ou facteurs mitogènes) permettant la prolifération cellulaire par une reprise de la division cellulaire.
• Une culture cellulaire synchrone peut être obtenue par ajout d’un inhibiteur de la polymérisation des microtubules (ex: colchicine) ou par perte d’adhérence des cellules en mitose.
• La formation d’un hétérocaryon, à l’aide de protéines virales, entre une cellule en phase G1 et en phase G2 ne provoque pas de changement au niveau des noyaux des cellules fusionnées.
• La formation d’un hétérocaryon, à l’aide de protéines virales, entre une cellule en phase S et en phase G1 ne provoque pas de changement au niveau des noyaux des cellules fusionnées.
• Lors de la formation d’un hétérocaryon entre une cellule en phase S et une en phase G1, provoque l’entrée en phase S du noyau de cette dernière.
• La protéolyse brutale de la cycline B par le protéasome passe par une étape de polyubiquitination des lysines par une poly-ubiquitinase (APC). Ceci entraine l’inactivation et la disparition du MPF (formé initialement de Cdk1 et cycline B) entraînant le passage de la métaphase à l’anaphase.
• Si p53 est inactif:

  • Cdk4 n'est pas phosphorylée
  • Phosphorylation de Rb qui deviendra inactif
  • Rb pourra pas empêcher cellule de poursuivre son cycle cellulaire
• La protéine p53 fonctionne en inhibant Cdk4, ce qui va permettre de conserver le Rb actif, et donc de bloquer la cellule en G1.
• • Les étapes de la mitose : Prophase - Prométaphase - Métaphase - Anaphase - Télophase
• Chaque centriole est formé de 9 groupes de triplets de tubule
• On distingue les deux centrioles, une mère et une fille.

  • Le centriole mère a des appendices distaux qui sont des systèmes d’ancrage à la membrane plasmique.
  • les deux centrioles sont reliés par des complexes protéiques et sont constitués chacun de 9 triplets de microtubules.
• Le centrosome :

  • principal MTOC (=centre organisateur des microtubules) de la cellule
  • périnucléaire
  • pas entouré par une membrane phospholipidique.
  • composé de deux centrioles, généralement orienté à 90°, perpendiculaire l’un de l’autre.
• En périphérie du matériel péricentriolaire, il y a une cinquantaine de complexes en anneaux de tubuline gamma, gammaTuRC complexes qui sont des sites de nucléation.
• L’acridine orange est utilisée lors de la cytoflurométrie de flux. L’intensité de la couleur va permettre de connaître la quantité d’ADN dans la cellule puisqu’elle est proportionnelle, donc plus la cellule est colorée, plus il y a d’ADN.
• L'analyse à l’acridine orange par cytofluorométrie de flux permet d'établir une courbe du nombre de cellules en fonction de la quantité d’ADN par cellule où l'on distingue trois populations cellulaires

  • l'une à 2n ADN,
  • l'une à 4n ADN
  • une quantité intermédiaire d'ADN entre 2n et 4n.
• La bromo-désoxyuridine est un analogue synthétique de la thymidine et non de la cytidine. Elle permet effectivement après intégration dans l’ADN, un marquage à l’aide d’un anticorps anti-BrdU.
• Il y 4 phases dans le cycle cellulaire et la quantité d’ADN varie au cours de ces 4 phases :

  • La phase G1 : 2n
  • La phase S : passage progressif de 2n à 4n
  • La phase G2 : 4n
  • La phase M : passe de 4n à 2n
• En phase S, on observe un arrêt progressif de synthèse des protéines, à l’exception de la synthèse des histones et des enzymes de l’anabolisme de la thymidine triphosphate.
• La colchicine bloque les cellules en métaphase, elle est souvent utilisée pour établir un caryotype.
• Deux hypothèses sont avancées pour expliquer l’entrée en sénescence d’une cellule :

  1. le raccourcissement des télomères
  2. l’accumulation du facteur P27/Kip1 lors des divisions cellulaires successives.
• La fusion d’une cellule en phase G1 avec une cellule en phase S permet de faire enter le noyau G1 en phase S.
• • Le facteur activateur de la phase S persiste tant qu’il existe des fourches de réplication de l’ADN.
  • Ensuite ce facteur disparaît en phase G2 afin d’éviter une double réplication de l’ADN.
• Le modèle de fusion cellulaire montre l’existence d’un rétrocontrôle dans le noyau G2 empêchant une double réplication de l’ADN.
• La rupture de l’enveloppe nucléaire lève le blocage de re-réplication de l’ADN mis en place lors de la transition S-G2.
• Le MPF (Maturation/mitose Promoting Factor) est constitué de deux protéines, la kinase cycline dépendante 1 (Cdk1) et la cycline B.
• Les complexes de Cdk-cycline ont une activité de phosphorylation via la sous unité cdk au niveau des sérines ou thréonines des protéines cibles.
• Chez la levure, l’ensemble du cycle cellulaire est contrôlé par deux complexes cyclines/CDK

  • l’un formé de la cycline G1 et de Cdc 2
  • l’autre formé de la cycline mitotique et de Cdc 2.
• Durant la phase M, les microtubules se réorganisent en fuseau mitotique, qui s’organise autour des deux centrosomes.

  • Cela permet la séparation des chromosomes en deux lots équivalents.
• Chaque centrosome est composé d´un diplosome (une paire de centrosomes perpendiculaires) et de matrice (matériel péricentriolaire).
• • microtubules kinétochoriens: responsables des mouvements des chromosomes,
  • microtubules astraux sont responsables de l´ancrage des centrosomes à la membrane
  • microtubules polaires sont responsables de la polarisation de la cellule.
• L´activation du MPF conduit, entre autres, à la phosphorylation des lamines, ce qui conduit à la rupture de l´enveloppe nucléaire.
• MPF est composé d´une sous-unité catalytique (CDK1) et d´une sousunité régulatrice (cycline B). Ce sera la sous-unité régulatrice (cycline B) qui sera ubiquitinée.
• La Taq est une enzyme thermostable:

  • stable à très haute température comme
  • provient d’une bactérie thermophile vivant dans des sources d’eau chaude
  • utilisée pour dénaturer l’ADN lors de la PCR (étape à 95°C).
• La pro-insuline est entièrement synthétisée par E. Coli grâce à l’insertion d’un gène humain dans un de ses plasmides.

  • former l’insuline utilisable pour le traitement du diabète il faut rajouter une étape de protélyse et de purification qu’E. Coli ne réalise pas et qui doit se faire in vitro.