Barwienia cytochemiczne

• Elementy kwaśne komórki

  • kwasy nukleinowe
  • białka jądra komórkowego
  • białka cytoplazmy
  • ziarnistości zasadochłonne granulocytów
• Z jakimi odczynnikami wchodzą w reakcję elementy kwaśne komórki?

  Z zasadowymi
• Z jakimi odczynnikami wchodzą w reakcję elementy zasadowe komórki?


  Z kwaśnymi
• Elementy zasadowe komórki

  • hemoglobina
  • zasadowe elementy cytoplazmy
  • ziarnistości kwasochłonne granulocytów
• Barwniki zasadowe

  • Błękit metylenowy
  • Zieleń metylenowa
  • Pyronina
  • Azur
• Barwniki kwaśne

  • Eozyna
  • Oranż G
  • Kwaśna fuksyna
• Jakie enzymy wpływają na aktywność peroksydazową leukocytów?

  Mieloperoksydaza i peroksydaza eozynofilowa
• W jakich komórkach aktywność mieloperoksydazy jest największa?

  Promielocyt, mielocyt i promonocyt
• W jakich komórkach aktywność mieloperoksydazy jest znaczna?

  dojrzałe granulocyty i mielocyt zasadochłonny
• PEROKSYDAZA EOZYNOFILOWA Metoda barwienia

  • Peroksydaza zawarta w leukocytach krwi lub szpiku uwalnia z dodawanego w reakcji nadtlenku wodoru rodnik tlenowy, który następnie utlenia substraty: benzydynę, diaminobenzydynę (DAB), aminoetylokarbazol (AEC) lub chloronaftol
  • W wyniku reakcji następuje zmiana barwy na zielonobrunatną
• Po co wykonywać barwienie na peroksydazę eozynofilową?

  • diagnostyka białaczek
  • diagnostyka rzadkich wrodzonych zaburzeń odporności
• Stwierdzenie aktywności MPO w >3% komórek blastycznych świadczy o szpikowym (mielo- lub monoblastycznym) pochodzeniu klonu białaczkowego.
• W jakich warunkach aktywność peroksydazowa spada?

  • W przebiegu infekcji
  • w rozsianych chorobach nowotworowych
  • jako objaw dysplazji w MDS
• Jaki procent masy granulocytów i limfocytów lipidy stanowią w warunkach fizjologicznych?

  5%
• Jak działa sudan czarny?

  Sudan czarny B tworzy nierozpuszczalne złogi w cytoplazmie granulocytów, natomiast nie uwidacznia się w limfocytach.
• W jakich komórkach sudanofilność jest największa?

  Dojrzałe granulocyty
• Jak przebiega metoda barwienia sudanem czaranym?

  • Utrwalone preparaty szpiku lub krwi barwi się w alkoholowym roztworze sudanu czarnego B w obecności fenolu.
  • Następnie po odpłukaniu w alkoholu preparaty dobarwia się hematoksyliną lub barwnikiem Giemsy.
• Po co barwić sudanem czarnym? - przydatność kliniczna

  Różnicowanie OBL (ostre białaczki limfoblastyczne) i OBNL (ostre białaczki nielimfoblastyczne)
• Wg WHO stwierdzenie obecności sudanu w co najmniej 3% komórek blastycznych wskazuje na szpikowy charakter białaczki
• Czym jest i jak działa fosfataza kwaśna i alkaliczna?

  Są hydrolazami, które odłączają reszty fosforanowe od fosfomonoestrów
• W jaki sposób określamy aktywność enzymatyczną fosfatazy kwaśnej?

  W reakcjach cytochemicznych do określenia aktywności enzymatycznej stosuje się naftol, który po uwolnieniu w środowisku kwaśnym jest sprzęgany z solami dwuazoniowymi tworząc nierozpuszczalny barwnik dwuazowy.
• W jakich komórkach jest najwiksza aktywność fosfatazy kwaśnej?

  Promielocytach
• Po co oznaczamy aktywność fosfatazy kwaśnej? - przydatność kliniczna

  Do diagnostyki białaczki włochatokomórkowej - izoenzym piąty dominuje w tej postaci białaczki i jako jedyny jest oporny na działanie winianu sodu
• W jakim pH jest aktywna fosfataza alkaliczna?

  zasadowe pH - zbliżone do 9
• W jakich komórkach aktywność fosfatazy alkalicznej jest największa?

  Osteoblasty i część makrofagów
• W jaki sposób mierzymy aktywność fosfatazy alkalicznej?

  Wykorzystujemy metodę półilościową w neutrofilach:

  • W każdym ze 100 napotkanych neutrofilów ocenia się nasilenie reakcji w skali od 0-4.
  • Wynik badania jest sumą punktów pochodzących ze 100 komórek.
  • Zakres referencyjny (zakres dolny to 15 – 35 pkt. a górna granica to 95 – 160 pkt.)
• W jakich sytuacjach poziom fosfatazy alkalicznej w granulocytach spada?

  • Przewlekła faza CML
  • Nocna napadowa hemoglobinuria
  • Niektóre MDS
• W jakich sytuacjach poziom fosfatazy alkalicznej w granulocytach wzrasta?

  • Inne fazy CML
  • Czerwienica prawdziwa
  • Odczyny białaczkowe
  • Neutrocytozy infekcyjne
  • Chłoniak Hodgkina
  • Niedokrwistość aplastyczna
  • Ciąża
• W jaki sposób wykonujemy barwienie na aktywność fosfatazy alkalicznej?

  • Utrwalony preparat inkubuje się w mieszaninie o pH ok. 9, zawierającej np. fosforan -naftylu.
  • Fosfataza alkaliczna zawarta w neutrofilach uwalnia naftyl, który jest łączony z solą dwuazoniową, dając barwny (czerwony) produkt.
  • Po inkubacji preparat podbarwia się hematoksyliną.
• Czym są esterazy?

  Esterazy są niejenorodną grupą enzymów hydrolizujących estry alkoholi i kwasów
• Jak działają esterazy swoiste?

  swoiście hydrolizują chlorooctan naftolu
• Jak działają esterazy nieswoiste?

  substratami są estry krótkołańcuchowe – octan -α - naftylu lub maślan naftylu
• W jakich komórkach jest wysoka aktywność esterazy nieswoistej?

  Monocyty, makrofagi, bazofile, megakariocyty
• W jakich komórkach jest duża aktywność esterazy swoistej?

  promielocyty, mielocyty obojętnochłonne, mastocyty
• Jakie są wskazania do badania aktywności esteraz w komórkach?

  • Diagnostyka ostrych białaczek szpikowych (mieloblastycznych i monocytowych)
  • Diagnostyka nowotworów mielodysplastycznych i mieloproliferacyjnych, zwłaszcza przewlekłej białaczki mielomonocytowej
• Neutrofile w naczyniach krwionośnych mają mniej glikogenu niż te, które zaczęły fagocytozę w tkankach
• W jakich komórkach jest duża zawartość glikogenu?

  w szeregu neutrofilowym
• W stanach patologicznych może dochodzić do pojawienia się dodatniej reakcji PAS w postaci grubych ziaren. Świadczy to o dyserytropoezie.
• W jakim celu wykorzystujemy reakcjęPAS?

  • Różnicowanie ostrych białaczek (limfoblastycznych i niektórych szpikowych np. AML-M6 i AML-M7)
  • Diagnostyka zespołów mielodysplastycznych
• Żelazo transportowane w osoczu w postaci związanej z transferyną, β-globuliną, będącą specyficznym białkiem nośnikowym. Po przejściu przez barierę szpikową transferyna łączy się z błoną erytroblastów, a żelazo przenika do wnętrza komórki. Większość żelaza wbudowywana jest do hemu, pozostała część łączy się z apoferrytyną tworząc ferrytynę (kompleks białko-żelazo).