micro lab

• Reglamento del Laboratorio

  • No se permite presencia de niños
  • No se permite juegos de mano
  • No se permite vocabulario soez
  • No se permite salir del laboratorio sin autorización una vez haya comenzado el mismo
  • No se permite la presencia de personas ajenas al laboratorio
• Código de Vestimenta

  • Es obligatorio el uso de una bata de laboratorio para prevenir la contaminación y para proteger de algún tipo de accidente como: salpicaduras con tintes o reactivos químicos
  • Se debe mantener la bata abotonada
  • Se prohíbe el uso del pelo suelto, gorras y ropa corta
  • Se usarán gafas de seguridad, mascarillas y guantes cuando sean requeridos
• Uso y cuidado del microscopio

  1. Partes mecánicas:

  2. Brazo: sostiene la parte superior del sistema óptico y provee espacio para agarre y su manejo

  3. Base: parte inferior por donde se sujeta al cargarlo

  4. Ganchos: colocados sobre la platina y sujetan la laminilla en la posición correcta

  5. Platina: localizada debajo de los objetivos y se utiliza para colocar las laminillas

  6. Carro Mecánico: movimiento horizontal (lado a lado en el eje x) la laminilla sobre la platina; permite explorar el campo de visión para encontrar la imagen de interés; se regula con el control de desplazamiento - x

  7. Control de desplazamiento – Y: mueve la laminilla hacia adelante y hacia atrás (eje de Y)

  8. Control de desplazamiento – X

  9. Tornillo Macrométrico: es el tornillo de mayor tamaño; se usa para desplazar la platina distancias grandes con los objetivos de 4x y 10x

  10. Tornillo Micrométrico: se utiliza para desplazar la platina a distancias muy pequeñas para afinar el enfoque; solamente se utiliza cuando observamos con objetivos de magnificación alta (40x y 100x)

  11. Partes Ópticas:

  12. Lentes Oculares: magnifica la imagen 10x; tiene un control de ajuste para optimizar la visión binocular compensando por diferencias en capacidad de visión de cada ojo; ajuste debe de dejarse en cero si se usan espejuelos o lentes de contacto

  13. Lentes Objetivos: Objetivo de rastreo (4x): permite observar el espécimen completo; se usa para encontrar la imagen

  14. Objetivo de baja potencia (10x): se usa para enfocar la imagen

  15. Objetivo de alta potencia (40x): visualización de la imagen con mayores detalles

  16. Objetivo de inmersión en aceite (100x): se usa con aceite, el mismo se añade antes de cambiar de objetivo, permite mayor resolución. Contiene una línea negra para distinguir el objetivo de aceite del resto
• En ausencia de aceite, los rayos de luz se refractan y no entran por el lente del objetivo. El aceite tiene el mismo índice de refracción que el cristal, previniendo el desvío y pérdida de luz, resultando en una imagen más detallada. El aceite puede aplicarse sobre un cubreobjetos o directamente sobre células teñidas previamente fijadas al calor
• Objetivo de inmersión en aceite (100x)


  • Se usa con aceite para mayor resolución. Contiene una línea negra para distinguirlo del resto
• Mantenimiento del microscopio: Antes de comenzar y al finalizar con el uso, limpiar únicamente con papel de lente el sistema de lentes, limpiar el objetivo de inmersión en aceite último para evitar transferir residuos de aceite a los demás lentes. Al finalizar el uso del microscopio, apagar la lámpara, colocar el objetivo de baja potencia orientado hacia la platina, subir la platina, enrollar el cable alrededor del brazo, colocar en lugar designado
• Condensador


  • Contiene 2 lentes que concentran la luz de la lámpara hacia los lentes del objetivo y el ocular
• Pasos inmersión de aceite

  Enfocar en 40x, rotar el revolver entre 40x y 100x, aplicar gota de aceite sobre el rayo de luz, cambiar a 100x, enfocar en 100x
• Control de Intensidad

  Aumentar o disminuir la intensidad de la luz puede mejorar el contraste de la imagen
• Objetivo de alta potencia (40x)


  • Visualización de la imagen con mayores detalles
• Ajuste del condensador


  Debe colocarse lo más cerca de la platina
• Diafragma

  • Ubicado debajo del condensador, regula la cantidad de luz emitida por la lámpara hacia el sistema de lentes
• Relación entre distancia de trabajo, objetivo y apertura del diafragma

  Efecto de la apertura del diafragma: Oscurecimiento del campo visual, Aumento en contraste
• Práctica: Observación de muestras de agua dulce énfasis diatomeas y protistas


  Observación de diversos tipos de microorganismos con tamaños que fluctúan entre las escalas de mm a µm
• Práctica I: GloGerm

  Se aplica aceite o gel de GloGerm a las manos, 2. Sujetar las manos debajo de la luz UV para visualizar la cobertura, 3. Lavar las manos con jabón y agua, 4. Visualizar nuevamente debajo de la luz UV para mostrar las áreas que no fueron lavadas correctamente
• Escalas de tamaño

  • Célula Eucariótica: 10um – 100um
  • Microscopio de luz: 1um – 1mm
  • Microscopio de electrones: 1nm – 100um
  • Ojo humano: 100um – 1mm
• Práctica III: Observación de muestras de agua dulce énfasis diatomeas y protistas


  Observación de diversos tipos de microorganismos con tamaños que fluctúan entre las escalas de mm a um
• Técnica de Gota Colgante: para observar microorganismos en muestras de agua


  Se utiliza una laminilla cóncava. 1. Colocar cuatro puntos de vaselina alrededor de la laminilla cóncava. 2. Colocar muestra de agua en el cubreobjetos. 3. Colocar la laminilla cóncava sobre el cubreobjetos que contiene la gota de agua. 4. Girar 180* para evitar que se riegue la muestra
• Clasificación de flagelos en bacterias

  • Átrico, Monótrico polar, Lofótrico, Anfítrico bipolar, Cofótrico, Perítrico
• Mechero

  Crear una columna de aire caliente que mantiene suspendidas partículas y microorganismos aerotransportados evitando que estos se depositen por gravedad y contaminen medios, materiales y equipo
• Technique of Streaking on Plate

  1. Tiene como propósito separar células o unidades formadoras de colonias (UFC; colony forming units, CFU) mientras se disminuye la carga de inóculo al esparcir la muestra sobre la superficie del medio

  2. Al separarse las células lo suficiente, formaran colonias distantes una de otra lo que permite: Detectar poblaciones diferentes en la muestra, Confirmar la pureza de un aislamiento mediante la detección de contaminantes (varios microorganismos presentes control de calidad)
• Mechero

  The ideal flame is pale blue with a darker blue core.
• Instruments used for transfers

  • Agujas de inoculación, espátulas Drigalski (“hockey stick”), autoaclaveado (toothpicks), hisopos (Q-tip)
• Adjusting flame height

  1. For a taller flame – open gas valve/dial more to allow more gas

  2. For a shorter flame – turn gas valve/dial back counter clockwise

  3. For a hotter flame – turn barrel counter clockwise (increases air flow) Flame should turn blue

  4. For a cooler flame – turn barrel clockwise (decreases air flow). Flame should turn orange

  5. To turn off: turn barrel clockwise for a cooler, orange flame. Completely turn off the gas valve/dial. Turn off gas line
• Colonies Forming Units

  Se asume que una colonia se origina a partir de una sola célula de un micr
• Transferencia de cultivos entre tubos con agar inclinado (“slant”)


  1. Forma correcta de sujetar los tubos: mantener alejadas las bocas de los tubos para facilitar la manipulación de los tubos al flamear

  2. Las tapas de los tubos no se colocan sobre el área de trabajo: Tapa del tubo 1 agarrada entre el meñique y la palma, Tapa del tubo 2 agarrada entre el anular y meñique

  3. Una alternativa más simple es dejar los tubos en la gradilla según se usen durante la transferencia. Pero no dejar las tapas sobre la mesa, siempre sujetarlas entre dedos o colocarlas en los tubos

  4. Estriado Zig-Zag: tipo de estriado más común, se usa en la transferencia de rutina para el mantenimiento de cultivos en medio fresco y para verificar la pureza de este

  5. Estriado en Línea Recta: Se usa para evaluar los patrones de crecimiento colonial en agar inclinado. El trazo de la transferencia se realiza sobre la superficie inclinada, desde el fondo de la inclinación hacia la boca del tubo

  6. Inoculación Estocada (pruebas de motilidad y fermentación): Estocado: agar, solido, agar semi-sólido (motilidad), Motilidad (crecimiento hacia las paredes del tubo), Fermentación de carbohidratos y producción de H2S en TSIA (en la fase superior es estriado en zigzag y la fase inferior es estocada)
• Unidades Formadoras de Colonias

  • Se asume que una colonia se origina a partir de una sola célula de un microorganismo (no necesariamente el caso)
  • Las colonias pueden originarse a partir de: Endosporas (ciertas bacterias), esporas/conidias (hongos), grupo de células bacterianas o grupo de células de tejido fungal
• Endosporas

  • Estructura de supervivencia producida por bacterias asociadas al suelo
  • Géneros Bacillus y Clostridium
  • Pueden dar origen a células que forman colonias
• Técnica de vertido en plato (crecimiento de células en agar derretido [medio sólido])


  En combinación con la técnica de diluciones: Permite enumerar y aislar colonias de organismos aerobios, anaerobios facultativos y aerotolerantes. Permite enumerar y aislar colonias dentro del agar y sobre la superficie sin la necesidad de hacer esparcidos
• Cultivo puro


  • Todas las colonias tienen la misma morfología. Almacenamiento corto/largo plazo y pruebas adicionales
  • La morfología de la colonia bajo condiciones de crecimiento estándares se utiliza como criterio de identificación de microorganismos
• Técnica de Estriado

  1. Transferencia de células de medio sólido o líquido a medio sólido

  2. Proceso: Se divide un plato Petri en 4 cuadrantes imaginarios. Se flamea y enfría la aguja entre el estriado 1 y 2, al igual que en el estriado 2 y 3 y al final de la racha. Se resuspenden las células si el medio es líquido. El objetivo es reducir el número de bacterias que crecen en cada área sucesiva del plato a medida que este se rota y se realiza el estriado, de manera que aparezcan colonias aisladas en los cuadrantes 3 y 4. No exponer el plato, procurar cubrir el medio con la tapa a 45* mientras se trabaja. Resultados: se puede ver la presencia de colonias con morfología distinta al igual que contaminantes. Algunos contaminantes podrían pasar desapercibidos.
• Esterilización

  Eliminación de carga microbiológica (destrucción o exclusión)
• Técnica de esparcido en plato

  1. Consiste en la dispersión y crecimiento de células en medio sólido (Platos Petri)

  2. Se usa en conjunto con la técnica de diluciones en serie

  3. Transferencia de células de medio líquido a medio sólido

  4.Esperar 5-10 segundos después de flamear el hockey stick

  5. Echar muestra en medio sólido

  6.Dispersar equitativamente sobre la superficie mientras se rota el plato Petri para separar las células en la superficie del medio

  7.incubar
• Crecimiento


  Depende de la disponibilidad de nutrientes (C, H, O, N, P, S) y parámetros fisicoquímicos óptimos (temperatura, pH, requerimientos gaseosos)
• Tipos de Esterilización

  • Autoclave: 121*C, 15lbs de presión, 15 min
  • Calor seco: horno de 160*C -170*C, 2 horas (Para cristalería y equipos, mechero)
  • Filtro bacteriológico: 0.9um a 1.4um < 0.22um
  • Luz ultravioleta: 260nm (superficies)
  • Óxido de etileno (gas): pipetas plásticas estériles
• Técnica de diluciones

  1. Permite enumerar y aislar colonias de organismos aerobios, anaerobios facultativos y aerotolerantes

  2. Permite enumerar y aislar colonias dentro del agar y sobre la superficie sin la necesidad de hacer esparcidos
• Medios de cultivos

  • Formatos: líquido o caldo, semisólido y sólido
  • Agar: agente solidificante derivado del alga roja Gelidium amansii. La cantidad de este ingrediente hace la diferencia entre un medio sólido y semisólido
  • Líquido o caldo: (0% de agar)(0g/1000mL): Se usa para obtener microorganismos en altas cantidades para un sin número de aplicaciones como estudios de fermentación, expresión de proteínas, pruebas bioquímicas.
• Medio de Cultivo

  • Mezcla de nutrientes que se utilizan para sostener el crecimiento de microorganismos y facilitar su manipulación
  • En conjunto con parámetros fisicoquímicos apropiados permite el estudio estructural y funcional de microorganismos
  • Deben ser esterilizados previo a su uso
• Clasificación de medios de cultivos

  • Medio Selectivo: Contiene uno o más componentes que permiten el crecimiento favorable de un grupo de organismos afectando el crecimiento de los demás, Medio Diferencial: No limita el crecimiento de microorganismos, pero contiene un componente que puede ser utilizado por algunos microorganismos y no por otros
• Agar inclinado (medio sólido)


  Los medios sólidos (15g agar/L) también se sirven derretidos (50*C) en platos Petri y luego se dejan solidificar al enfriarse. El medio preparado en plato permite: aislar cultivos puros; enumerar microorganismos y observar detalles de la morfología de las colonias