Handhabung

• PERFUSIONSSYSTEME


  Konstante Nährstoffversorgung, Abtransport von Stoffwechselend produkten, Nochahmung natürlicher physiolog. Bedingungen (z.B. Blut-kreislauf)
• PERFUSIONSSYSTEME

  • Aufwendig
  • Kostspielig
• Passagieren / subkultivieren

  1. Subkultivierung

  2. Mediumwechsel

  3. Mediumwechsel

  4. Mediumwechsel
• Konfluenz


  Lückenloses Bedecken der Kulturgefäßoberfläche
• Enzymatischer Verdau

  1. Überführung in Zellsuspension

  2. Überführung in neues Kulturgefäß
• Shake-Off-Verfahren


  1. Lösen der Zellen durch Abklopfen der Kulturschale auf untergrund

  2. Überführen der Zellen in Suspension durch Abspülen der Kulturen mit Medium
• Papain

  • Protease nichttierischer Herkunft, erfordert Zusatz von Cystein
• Collagenase


  • Spaltung von Kollagen, schonende Subkultivierung
• Liberase


  • Handelsname bakterieller Collagenasen
• DNAse

  Hydrolyse freigesetzter DNA, gegen Verklumpung der Zellen
• Passagieren durch Abschaben

  Mechanische Dissoziation durch Gummischaber
• Einsaatdichte (seeding density)

  Erforderliche Zellzahl, die benötigt wird, um eine ausreichende Zell-Zell-kontakt zu gewährleisten und das Kulturmedium durch Sekretion spezifischer Wachstumsfaktoren zu konditionieren
• Verdünnungsfaktor (split ratio)


  Faktor, um den eine Zellkultur verdünnt werden muss, um eine definierte Anzahl von Zellen in einem neuen Kultur zu erreichen
• Kritische Einsaatdichte: Zell-Zell-Kontakt, Konditionieren des Kulturmediums durch Sekretion spezifischer Wachstumsfaktoren
• Mikroskopische Betrachtung der Kulturen: Morphologische Veränderungen, Zellveränderungen, Kontaminationen, Dokumentation durch Fotoserie
• Bestimmung der Zellzahl

  Mittels Zählkammer, optisch basierte Zellzähler, elektrisch basierte Zellzähler
• Elektrisch basierte Zellzähler


  Widerstandsmessung: Widerstandserhöhung durch intakte Zellen
• Vorgehen elektrisch basierte Zellzähler

  1. Resuspension der Zellen in isotonischer Elektrolytlösung

  2. Ansaugen von Lösung in Messkapillare

  3. Widerstandsänderung bei Eintritt einer Zelle durch Messpore

  4. Zählen der Zelle
• Bestimmung der Zellzahl in Monolayer-Kulturen: Zunahme der Zelldichte
• Bestimmung der Zellzahl nach Trypsinierung: Zerstörung der Kultur
• Wachstumskurve

  Lag-Phase, exponentielle (log-) Phase, Plateau-Phase
• Generationszeit


  Benötigte Zeit für die Teilung einer Zelle
• Populationsverdopplungszeit

  Zeit für die Verdopplung der Zellzahl in Kultur
• Verdopplungszeit


  Zeit für die Verdopplung der Zellmasse
• Berechnung der Zellzahl

  Mittelwert aus 4 großen Quadraten mit 10 multiplizieren, ergibt Zellkonzentration pro ml, Gesamtzellzahl aus Volumen der Zellsuspension mal Zellzahl pro ml
• Mögliche Fehlerquellen: unkorrekte Durchmischung, zu verdünnte oder zu dichte Zellsuspension
• Gegenüberstellung optisch basierter und elektrisch basierter Messverfahren


  • Zellvitalität
  • Probenvolumen
  • Größenbereich
  • Maximale Aggregatgröße
  • Messzeit
• Automatisierte Zellzähler: hohe Investitions- und Wartungskosten, Verbrauchsmaterial
• Mediumswechsel und Fütterungszyklen


  Abhängigkeit der Stoffwechselaktivität von der jeweiligen Zellkultur

  -> Metabolisierung oder Zerfall der Zusätze

  -> Handling: halber Mediumswechsel
• Wozu dient ein halber Medienwechsel?


  Hälfte des Mediums wird entfernt

  -> Überfütterung der Zellen vermeiden

  -> optimales Wachstum fördern

  -> Abfall aus abgebautem Medium entfernen
• Perfusionssysteme- Vorteile


  Konstante Nährstoffversorgung

  Abtransport von Stoffwechselendprodukten

  Nachahmung natürlicher physiologischer Bedingungen (z.B. Blutkreislauf)
• Perfusionssysteme- Nachteil


  aufwendig

  kostspielig
• Passagieren/ Subkultivieren?

  • Abhängigkeit der Wachstumsgeschwindigkeiten von der jeweiligen Zellkultur
  • Konfluenz: lückenloses Bedecken der Kulturgefäßoberfläche
  • Kontaktinhibition bei einigen Zelllinien
  • Abnahme der Proliferationsrate
  • evtl. Absterben der Kultur
• Passage Handling

  Enzymatischer Verdau

  Überführung in Zellsuspension

  Überführung in neues Kulturgefäß
• Welche Passagier-Möglichkeiten gibt es?

  Shake-Off-Verfahren

  Passagieren mit Trypsinieren bzw. enzym. Verdau

  Passagieren durch Abschaben
• Shake-Off-Verfahren?

  • wenig adhärente Zellen und in Mitose befindlichen Zellen
  • Lösen der Zellen durch Abklopfen der Kulturschale auf Untergrund
  • Überführen der Zellen in Suspension durch Abspülen der Kulturen mit Medium
  • Nachteil: geringe Zellausbeute
  • Beispiel: CHO (Chinese Hamster Ovary)
• Passagieren mit Trypsinieren/ enzym. Verdau?

  • Trypsin = Endoprotease -> Spaltung zw. Lys- Arg
  • Inhibition von Trypsin z.B. durch Serum
  • pH-Optimum: 7,5 - 7,8
  • Temperaturoptimum: 37°C
  • Einwirkzeit: 3-10 min
  • EDTA: Ca²+/ Mg²+ - Chelator -> Reduktion der Zell- Zell -Adhäsion + erhöhte Aktivität des Trypsins
  • Vorsicht: nicht zu häufige Einfrier- und Auftauzyklen!!
• Proteasen?

  Trypsin

  Papein : Protease nichttierischer Herkunft, erfordert Zusatz von Cystein

  Collagenase: Spaltung von Kollagen, schonende Subkultivierung -> Co-Faktor: Ca²+-Ionen

  Liberase: Handelsname bakterieller Collagenasen

  DNAse: Hydrolyse freigesetzter DNA, gegen Verklumpung der Zellen
• Passagieren durch Abschaben?

  Mechanische Dissoziation durch Gummischaber
• Was ist PBS?

  phosphatgepufferte Salzlösung