ADLİ GENETİK PROFİLLEME

• Adli Genetik

  DNA bazlı çalışmalar, olay yerinden alınan DNA örnekleri ile suçlu olduğu düşünülen kişilerin DNA örneklerinin karşılaştırılması
• Alec Jeffreys 1984 yılında protein bazlı tekniklerden "DNA parmak izini" geliştirmiş ve DNA bazlı Adli Genetik çalışmalarına öncülük etmiştir
• Adli Genetik

  • Olay yerinden alınan DNA örnekleri ile suçlu olduğu düşünülen kişilerin DNA örneklerinin karşılaştırılması
  • İki bireyin akraba olup olmadığının belirlenmesi
  • Kimliği belirlenemeyen kişilerin tespiti
  • Arkeolojik kazılardan çıkan örnekler için de adli DNA analizleri yapılması
• Hayvanlar, bitkiler, bakteriler ve diğer mikroorganizmaların hepsi DNA taşımaktadır
• DNA


  Her canlıya özgü dizilimi ve ayırt edilmeyi sağlaması bakımından adli çalışmalarda çok önemli bir yere sahiptir

  
• İnsanlardaki DNA örnekleri

  • Saç(köklü)
  • Tırnak
  • Sperm, vajen ifrazatı
  • İdrar ve dışkı
  • Kemik ve dişler
• Protein bazlı çalışmalara örnek olarak kan serumu, insan lökosit antijeni (HLA) kullanılarak profillendirmeler yapılmaktaydı
• DNA teknolojisi yöntemi ile profillendirmeler daha çok tercih edilmektedir
• Polimorfizm


  Belli bir popülasyondaki bireyler arasında gen bölgelerinde (lokuslarda) bulunan bir genin iki veya daha fazla alelinin belli sıklıkta görülmesi

  
• DNA teknolojisi ile yapılan DNA profillendirmeleri

  • Gen dizisinde kodlama yapmayan bölgeleri hedef alınması
  • Bu bölgeler fenotip üzerine etkisi olmadığı varsayılsa da çalışmalar sürmektedir

  
• VNTR (variable number tandem repeats)


  DNA'da tekrarlayan bölgeler, her bireyde farklı sayıda tekrara sahiptir
• Adli Genetik


  Adli analizlerde kullanılan DNA analizleri

  
• VNTR'lerin doğal seçilimden etkilenme olasılığı daha düşüktür ve bu da farklı popülasyonlarda farklı frekanslara yol açabileceği anlamına gelmektedir
• Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)


  Kary Mullis ve ark. tarafından 1983 yılında geliştirilmiş, özgün/hedef DNA dizilerinin in vitro olarak çoğaltılmasına olanak sağlayan bir teknik

  
• VNTR lokuslarından profillendirme


  1. DNA izolasyonu

  2. DNA belirli bir enzim tarafından her hücrede milyonlarca küçük parçaya bölünür

  3. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfirzm) tekniği ile DNA dizisindeki tekrarlayan polimorfik bölgeler tespit edilip restriksiyon enzimleri ile kesimi

  
• PCR tekniği Nobel ödülünü getirdi

  1993
• RFLP


  Sınırlayıcı enzim bölgeleri polimorfizmi

  
• PCR, Adli analizlerde olmaz ise olmaz tekniklerden biri haline gelmiştir
• STR (short tandem repeats)

  Adli genetikte yaygın olarak kullanılan ve basit dizi tekrarları

  
• PCR işleminin bileşenleri


  • Kalıp DNA
  • İki primer (Forward- Reverse)
  • Dört çeşit deoksinükleotid trifosfat (dNTP)
  • Tampon sistemi (Mg+ içeren)
  • DNA polimeraz

  
• STR'ler, zaman, ekonomi, güvenirlilik gibi avantajlarından dolayı bugün adli genetikte kullanılmaktadır
• DNA Polimeraz


  Thermus aquaticus (Taq DNA Polimeraz)'dan izole edilmiş, 70-75°C sıcaklıklardaki su kaynaklarında yaşayabilme yeteneğine sahip bir termofilik bakteri
• STR'ler


  • Farklı boyutta olmaları bakımından RFLP'ye benzer varyantları jel elektroforezi ile tespit edilebilmesi
  • Tekrar dizileri farklı boyutlarda basit dizi tekrarının katları şeklinde gözlemlenmesi

  
• Standard PCR için Termal Siklus Profili

  1. Başlangıç denatürasyonu

  2. Denatürasyon

  3. Bağlanma

  4. Uzama

  5. Uzama sonrası

  
• DNA profilleme


  1. Doku veya vücut sıvılarından DNA örneklerinin toplanması

  2. DNA izolasyonu

  
• PCR siklusunun son ürünü başlangıçta tek bir kopya hedef DNA'nın 2 kopyasıdır ve bu iki kopyanın her bir ipliği bir sonraki siklus için kalıp görevi görür
• Organik ekstraksiyon


  Hücre duvarlarını parçalamak için sodyum dodesilsülfat (SDS) ve proteinaz K kullanılması, proteinleri DNA moleküllerinden ayırmak için fenol-kloroform karışımı eklenmesi
• Chelex ekstrasyonu


  İyon değişimi ile DNA'nın saflaştırılması yöntemi, tek aşamada tek iplikli saf DNA ürünü elde edilmesi

  
• Amplifikasyon işlemi devam ettikce DNA dizisi her siklusta iki katına çıkar
• Adli analizlerde kullanılan maksimum siklus sayısı 34'ü geçmez (4 milyar kopya)
• DNA ekstraksiyon yöntemleri


  • Organik ekstraksiyon
  • Chelex ekstraksiyonu
• PCR Fazları


  • Eksponansiyel: her siklusta ürünün tam olarak duplike olduğu safha (100% Reaksiyon etkinliği)
  • Lineer: Reaksiyon ürünleri tükendikçe reaksiyon yavaşlar ve ürünler bozulmaya başlar
  • Plato: Reaksiyon durur ve daha fazla ürün üretilmez

  
• Organik ekstraksiyon


  1. Hücre duvarlarını parçalamak için sodyum dodesilsülfat (SDS) ve proteinaz K kullanılır

  2. Proteinleri DNA moleküllerinden ayırmak için fenol-kloroform karışımı eklenir

  3. Santrifüj ile dibe çöken proteinler ve diğer hücresel kalıntılar, çift sarmallı DNA içeren sulu fazdan çekilebilir
• DNA PARMAK İZİ PROFİLLEME

  DNA'nın kimyasal yapısı herkesde aynıdır ancak baz çiftlerinin dizilimlerinde bazı farklılıklar bulunur, bu baz çiftleri kullanılarak insanlar bireysel olarak tanımlanabilir
• Chelex ekstraksiyonu

  1. İyon değişimi ile DNA'nın saflaştırılması

  2. Chelex reçine süspansiyonu örneğe doğrudan eklenir

  3. DNaz'lar için temel bir kofaktör olan Mg2+ reçine boncuklarına bağlanarak solüsyondan ayrılır

  4. Tek aşamada tek iplikli saf DNA ürünü elde edilir

  5. DNA ve RNA'nın yapısının bozulmadan kalabilmesini sağlayan kimyasallar içeren FTA kâğıdında kurumuş örneklerin kısa zamanda ve tek aşamada izolasyonu sağlanır
• DNA PARMAK İZİ ÇIKARMA SÜREÇLERİ

  1. DNA'nın ekstre edilmesi ve restriksiyon enzimleri kullanılarak fragmentlere ayrılması

  2. Fragmantlerin elektroforez yardımı ile agaroz jel üzerinde ayrılması

  3. DNA bant desenlerinin naylon membran üzerine transfer edilmesi

  4. Radyoaktif işaretli DNA problarının naylon membran üzerindeki özgün DNA dizilerine bağlanması

  5. Fazlalık prob materyalinin yıkanarak uzaklaştırılması

  6. Radyoaktif DNA deseninin X-Ray film üzerine aktarılması

  
• Silika bazlı DNA izolasyon

  1. Silika ya da cam partiküllerin bağlanma özellikleri kullanılır

  2. Tuz veya uygun pH varlığında DNA silika veya cam partikülüne bağlanır

  3. Silikaya bağlanmış olan DNA, ortamdaki diğer hücre elemanlarının uzaklaştırılması ile ayrılarak saf olarak elde edilir
• Restriksiyon endonükleazlar


  • Küt uçlar oluşturan enzimler (PvuII, AluI)
  • Yapışkan uçlar oluşturan enzimler
• Diferansiyel DNA izolasyonu


  Tecavüz vakalarında erkeğe ait sperm ve kadına ait epitel hücreler karışmaktadır ve bu karışmış DNA örneğinin profillemesinde zorlukları aşmak için kullanılır

  
• Laboratuvarda hedef DNA'nın bir restriksiyon enzimi ile kesilmesi