metody barwienia

• Metody barwienia

  - bezpośrednie

  - różnicujące

  - w kierunku bakterii kwasoopornych

  - fluorescencyjne
• Badanie bezpośrednie


  - Preparat natywny, przyżyciowy

  - 10% KOH

  - Tusz chiński

  - Plyn Lugola
• Preparat natywny , przyżyciowy


  Niebarwiony preparat może być badany z użyciem mikroskopu jasnego pola, ciemnego pola lub mikroskopu kontrastowo - fazowego .
• 10 % KOH


  KOH używany jest w celu rozpuszczenia materiału białkowego i ułatwienia detekcji elementów grzybów , które nie są niszczone przez silne roztwory zasadowe . Aby zwiększyć kontrast między elementami grzybów a tłem można dodać barwniki , takie jak laktofenol .
• Tusz chiński

  Tusz jest dodawany jako materiał kontrastujący, barwiący tło. Barwnik używany głównie do wykrywania Cryptococcus spp. w płynie mózgowo-rdzeniowym i innych płynach ciała. Polisacharydowa otoczka Cryptococcus spp. nie absorbuje tuszu tworząc aureole wokół komórki drożdży.
• Plyn Lugola

  Plyn Lugola dodawany jest do bezpośrednich preparatów pierwotniaków pasożytniczych w celu wzmocnienia kontrastu struktur wewnętrznych. Ułatwia odróżnienie między pierwotniakami a białymi krwinkami gospodarza.
• Barwienie metodą Grama


  Jest to barwienie najpowszechniej używane w laboratoriach mikrobiologicznych, tworzące podstawę do wydzielenia głównych grup bakterii (np. bakterie Gram-dodatnie , bakterie Gram-ujemne). Po utrwaleniu próbki na szkiełku mikroskopowym (przez podgrzewanie lub stosowanie alkoholu), nanoszony jest fiolet krystaliczny, a następnie dodawana jest jodyna (płyn Lugola) w celu wytworzenia kompleksu z podstawowym barwnikiem. Kolejno podczas odbarwiania alkoholem lub acetonem kompleks jest zatrzymywany w bakteriach Gram-dodatnich, ale eliminowany w organizmach Gram-ujemnych. Następnie kontrastowe barwienie safraniną lub fuksyną uwidacznia się w organizmach Gram-ujemnych (stąd ich czerwony kolor). Stopień, w jakim mikroorganizm pozostanie wybarwiony, zależy od typu drobnoustroju, warunków posiewu i umiejętności osoby wykonującej barwienie.
• Barwienie hematoksyliną żelazową


  Używane do detekcji i identyfikacji pierwotniaków w kale. Jaja robaków pasożytniczych i larwy zatrzymują barwnik i są dużo łatwiej identyfikowane w preparacie bezpośrednim przyżyciowym.
• Barwienie srebrem


  Zazwyczaj wykonywane w laboratoriach histologicznych częściej niż w laboratoriach mikrobiologicznych. Używane głównie do wykrywania elementów grzybów w tkance, chociaż inne organizmy (takie jak bakterie) mogą również zostać wykryte. Barwienie srebrem wymaga umiejętności, ponieważ niespecyficzne barwienie może uczynić preparat niemożliwym do zinterpretowania.
• Barwienie błękitem toluidyny O


  Używane głównie do wykrywania Pneumocystis w próbkach z układu oddechowego. Cysty barwią się na kolor rudawy do fioletowego na jasnoniebieskim tle. Zabarwienie tła jest usuwane przez użycie utleniających związków siarki. Komórki drożdży również barwią się tą metodą i są trudne do odróżnienia od komórek Pneumocystis. Formy wegetatywne (trofozoity) pierwotniaków pasożytniczych nie barwią się. Wiele laboratoriów zastąpiło to barwienie specyficznym barwieniem fluorescencyjnym.
• Barwienie trójbarwne


  Barwienie pierwotniaków stanowiące alternatywę dla barwienia hematoksyliną żelazową. Pierwotniaki mają cytoplazmę niebieskawozieloną do purpurowej z czerwonym lub rudawym jądrem i ciałkami wtrętowymi; tło próbki jest zielone.
• Barwienie metodą Wrighta - Giemsy


  Używane do wykrywania pierwotniaków krwi, ciałek wtrętowych wirusów, mikroorganizmów z rodzaju: Chlamydia, Borellia, Toksoplazma, Pneumocystis i Rickettsia. Używany jest wielokolorowy barwnik zawierający mieszaninę błękitu metylenowego, azuru B i eozyny Y. Barwnik Giemsy łączy błękit metylenowy i eozynę. Jony eozyny są naładowane ujemnie i barwią zasadowe składniki komórki na pomarańczowy do różowego, podczas gdy inne barwniki barwią kwasowe struktury komórki na różne odcienie od niebieskiego do purpurowego. Trofozoity pierwotniaków mają czerwone jądro i szarawoniebieską cyto- plazmę, wewnątrzkomórkowe drożdże i ciałka wtrętowe wirusów typowo barwią się na niebiesko. Riketsje, chlamydie i Pneumocystis spp. barwią się na purpurowo.
• Barwienie różnicujące


  - metodą Grama

  - hematoksyliną żelazową

  - srebrem

  - błękitem toluidyny O

  - trójbarwne

  - metodą Wrighta-Giemsy
• Barwienie metodą Ziehl - Neelsena


  Używana do barwienia mykobakterii i innych mikroorganizmów kwasoopornych, które są barwione zasadową fuksyną karbolową. Metoda opiera się na odbarwianiu w roztworach kwasowo-zasadowych pozostałych, niekwasoopornych bakterii. Tło jest barwione kontrastowo błękitem metylenowym. Organizmy kwasooporne są czerwone na jasnoniebieskim tle. Wchłanianie fuksyny karbolowej wymaga podgrzewania próbki (gorące barwienie kwasooporne).
• Barwienie metodą Kinyoun


  Zimne barwienie w kierunku bakterii kwasoopornych (nie wymaga podgrzewania, tylko dłuższego czasu ekspozycji na fuksynę). Takie same zasady jak przy barwieniu metodą Ziehl-Neelsena.
• Barwienie auraminą-rodaminą


  Takie same zasady jak przy innych metodach w kierunku bakterii kwasoopornych, ale w tym przypadku przy podstawowym barwieniu używane są barwniki fluorescencyjne (auramina i rodamina), a nadmanganian potasu (silny czynnik utleniający) jest kontrastem i inaktywuje niezwiązany fluorochrom. Organizmy świecą na żółtawozielono na czarnym tle.
• Zmodyfikowane barwienie w kierunku kwasooporności


  W tym barwieniu używany jest słaby czynnik odbarwiający. O ile mykobakterie są wysoce oporne na odbarwianie przez kwasy, to inne organizmy kwasooporne odbarwiają się łatwiej (np. Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia, Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis i Cyclospora). Organizmy te mogą być barwione bardziej efektywnie z użyciem słabych czynników odbarwiających. Organizmy, które zachowują fuksynę wewnątrz komórki w tym barwieniu, są zaliczane do częściowo kwasoopornych .
• Barwienie w kierunku bakteri kwasoopornych


  - Ziehl-Neelsena,

  - Kinyoun

  - Barwienie auraminą-rodaminą

  - Zmodyfikowane barwienie w kierunku kwasooporności
• Berwienie fluorescencyjne


  - Barwienie oranżem akrydyny

  - Barwienie auraminą- rodaminą

  - Barwienie kalkofluorem

  - Barwienie fluorescencyjne z użyciem przeciwciał

  - KOH, wodorotlenek potasu .
• Barwienie oranżem akrydyny


  Używane jest do wykrywania bakterii i grzybów w próbkach klinicznych. Barwnik wnika do kwasów nukleinowych (natywnych i zdenaturowanych). W pH obojętnym bakterie, grzyby i elementy komórkowe barwią się jednolicie na kolor czerwonopomarańczowy. W pH kwaśnym natomiast mikroorganizmy zabarwione są na czerwonopomarańczowo a tło staje się zielonożółte.
• Barwienie kalkofluorem


  Używane do wykrywania struktur grzybów i Pneumocystis spp. Fluorescencyjny barwnik wiąże się z chityną i celulozą w ścianie komórkowej mikroorganizmów (wiele laboratoriów zastępuje tradycyjną metodę z KOH tym barwieniem).
• Barwienie fluorescencyjne z użyciem przeciwciał


  Przeciwciała (monoklonalne lub poliklonalne) są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym. Swoisty kompleks z mikroorganizmem jest wykrywany poprzez obecność fluorescencji. Technika jest używana do wykrywania lub identyfikacji różnych mikroorganizmów (np. Streptococcus pyogenes, Bordetella, Francisiella, Legionella, Chlamydia Pneumocystis, Cryptosporidium, Giardia, wirus grypy, wirus Herpes simplex). Czułość i swoistość metody jest zależna od liczby organizmów obecnych w próbce i od jakości znakowanych przeciwciał używanych w teście.