Zellkulturmodelle

• Primärkultur

  In vitro-Zuchtungen von Zellen, Geweben und Organen, die direkt aus dem Organismus entnommen wurden

  1. Dissoziation von Gewebe in Einzelzellen
  2. Auswaschen von Einzelzellen aus Gewebe
• Sekundärkultur

  Subkultivierung von Erstkulturen
• Hayflick-Limit


  limitierte Replikationsfähigkeit kultivierter Linien aus Primärkulturen
• Entwicklung einer Zelllinie aus Primärkulturen

  Ausweg: spontane oder induzierte genetische Veränderungen

  • Transformation
  • Immortalität
• Eigenschaften von transformierten Zellen

  • aneuploid
  • Verlust der Kontakthemmung
  • geringere Ansprüche an Serumgehalt
• Nomenklatur

  • Immortalisierung durch Z.B. Expression der humanen Telomerase (hERT), Expression von Onkogenen
  • Transformierter Zelltyp:
  • durch Transfektion, virale Infektion, Strahlung,...., immortalisierte Zelle
• nenne 4 Präparationsmethoden für Primärkulturen

  1. enzymatisch
  2. Aufreinigung
  3. mechanisch
  4. immunologisch
• Organotypische Kulturen

  • Erhalt der lokalen Gewebearchitektur zur besseren Nachahmung der in-vivo Situation
  • abweichende Morphologie, Genexpression, Signaltransuktion, etc. zu Monolayern
• akute Schnitte


  unmittelbar nach Gewinnung, ohne weitere Kultivierung
• organotypische Schnitte


  explantierte Gewebeschnitte, die weiterkultiviert werden
• 3D-Kulturen

  bessere Nachahmung gewebephysiologischer Eigenschaften als in 2D

  • erhöhte Lebensfähigkeit
  • verbesserte zelltypspezifischen Funktionen (z.B. Morphologie, Genexpression, Signaltransduktion, Zellkernstruktur)

  Speicherung von Wachstumsfaktoren

  Anwendung: Wirkstoffscreening aufgrund höherer Effizienz bei der Identifikation von Wirkstoffkandidaten
• Arten von 3D-Kulturen

  1. trägerfreie Systeme
  2. Sphäroide
  3. trägergestütze Systeme
  4. natürliche EZM-Gele
  5. künstliche Gele + Beschichtung mit EZm-Proteinen
  6. natürliche oder synthetische Gerüste
  7. Nanofasern aus Glas, Keramik oder Titan
• natürliche EZM-Gele


  Kollagen I

  Fibringele

  Matrigel ( Laminin, Nidogen, Kollagen IV, Heparansulfat-Proteoglykanen)
• künstliche Gele + Beschichtung mit EZM-Proteinen

  Polyethylenglykol

  Alginat

  Polysaccharid
• Sphäroide Bildung

  1. Lockere Zellaggregate

  2. Verzögerungsphase

  3. Kompaktierung
• Zellen in Sphäroiden

  • Proliferierende Zellen
  • Ruhende vitale Zellen
  • Nekrotischer Kern
• MCS


  Bildung multi zellulärer, kugelförmiger Aggregate → Sphäroide" (multicellular spheroid)
• Sphäroide


  • Bildung der eigenen extrazellulären Matrix -Komponenten, Zell-Zell- und Zell-EZM-Kontakte
  • Durchmesser zw. 30 und 50pm (max. ca. 500 μm)
• Anwendungen von Sphäroiden

  • Modellsysteme für Krebs- und Wirkstoffforschern
• Forced-Floating-Technik


  Verhinderung der Adhärenz durch Zellkulturgefäße mit einer speziellen anti-adhäsiven Oberflächenbeschichtung
• Möglichkeiten der Sphäroidherstellung

  1. Forced-Floating-Technik
  2. Hanging-Drop-Methode
• Hanging-Drop-Methode

  • Platzierung von Einzelzellen in einem Tropfen Zellkulturmedium an den Deckel einer Zellkulturschale
  • Akkumulation der Zellen aufgrund der Schwerkraft am tiefsten Punkt des Tropfens und Bildung von Sphäroiden
  • Minimierung von Verdunstungseffekten durch Zugabe von Medium in Cavität
• Nachteile der 3D-Kulturen

  • aufwändige Etablierung der 3D-Kulturen
  • höhere Kosten
  • Zugang zu Zellen
  • aufwändigere Analysemethode (Mikroskopie, Analyse sezernierender Faktoren)
  • erschwerte BEdingungen für automatisierte Analyseverfahren
  • erschwerte Replizierbarkeit
• enzymatische Zellisolierung


  Perfusion von Geweben und Organen mit spezifischen Protease- oder Peptidaselösungen, Sammeln der Zellen im Effluat und Kultivierung der herausgelösten Zellen
• Arten der Zellisolierung

  • enzymatisch
  • Aufreinigung
  • mechanisch
  • immunologisch
• Zellisolierung: Aufreinigung


  Zentrifugation der (enzymatisch gewonnenen) Zellsuspension im Dichtegradienten, Isolierung und Kultivierung der Zellen aus spezifischen Banden;

  Isolierung von Blutzellen im Dichtegradienten
• mechanische Zellisolierung


  Mikrodissektion:

  z.B. Mikrodissektion von Tubulusfragmenten der Niere und Auswaschen nephronspezifischer Zellen unter geeigneten Kulturbedingungen
• immunologische Zellisolierung


  Immundissektion:

  Anheftung einer Zellpopulation an Kulturschalen, die mit spezifischen Antikörpern vorbeschichtet wurden

  Immunselektion:

  Anreicherung einer Zellpopulation durch Bindung an spezifische Antikörper, die an magnetische Mikropartikel gekoppelt sind
• Zelllinie


  Population von Zellen, die durch Subkultivierung aus einer Primärkultur hervorgegangen ist
• Zelllinien mit begrenzter Lebensdauer (endliche Zelllinie)


  nur über eine begrenzte Anzahl von Passagen kultivierbar
• Zelllinien mit unbegrenzter Lebensdauer (Kontinuierliche Zelllinien)


  die Zellen sind unbegrenzt kultivierbar, aber nicht notwendigerweise transformiert
• Stammzellen / Stammzelllinien


  embryonale Stammzellen können im undifferenzierten Stadium gehalten und unbegrenzt kultiviert werden, können je nach Potenz in spezifische Zellarten differenzieren
• Tranformation

  transformierte Zellen weisen starke Veränderungen im Phänotyp gegenüber einer normalen Zelle auf

  normale Zellen können in-vitro transformiert werden
• Immortalisierung


  Zellen sind unbegrenzt kultivierbar, zeigen aber den Phänotyp einer normalen, nichttransformierten Zelle

  Zellen können spontan immortalisieren