Grundlagen der Zellkulturtechnik

• Was ist das Ziel der Zellkulturtechnik?


  Angleich der in-vitro Situation auf die in vivo Situation
• Welche Faktoren müssen bedacht werden, um das Ziel der Zellkulturtechnik (Angleich in- vitro auf in vivo) zu erreichen??

  • lösliche Faktoren: Nährstoffe, Vitamine, Wachstumsfaktoren und Hormone, Ca2+ und Mg2+, O2 und CO2
  • Zellarchitektur und Zellpolarität: epitheliale Gewebekultur basolaterale Nährstoffversorgung
  • Zell-Matrix-Interaktionen: chemische Natur der Kulturunterlage, Oberflächenladung, komplexe extrazelluläre Matrix
  • Zell-Zell-Interaktionen: Zelldichte, Konfluenz, Zellverbindungen
• Was ist in einem Zellkulturlabor drin?

  hängt von Sicherheitsstufe ab

  spezielles Geschirr

  • Reinraumarbeitsbank
  • Inkubator
  • Mikroskop / Inversmikroskop / Fluoreszenzmikroskop
  • Vorratsschrank
  • CO2-Schrank
  • Kühlschrank, Tiefkühler, Tiefkühltruhe
• Wie sind die Regeln für ein Zellkulturlabor?

  Trennung des Zellkulturlabors von anderen Laborräumen

  Verwendung eigener Zellkulturchemikalien und Gerätschaften

  Arbeitsbereiche:

  abhängig von gesetzl. Auflagen u. Raumkapazitäten

  steriler Arbeitsbereich

  Reinigungsbereich

  Vorbereitungsbereich

  Schleusensysteme (abhängig von Sicherheitsstufe)
• Welche Bereiche gibt es in einem Zellkulturlabor?

  1 Reinigungsbereich

  Laborspülmaschine, Trockenschränke, Autoklav, Wasseraufbereitungsanlage, Spültisch

  2 Vorbereitungsbereich

  Gas-, Wasser-, Elektroanschlüsse, Aufbewahrungsraum, Stauraum, Leitfähigkeitsmessgerät, pH-Meter, Magnetrührer, Schüttler, Osmometer, Kühl-/Gefrierkombi, Tiefgefrierschrank (-80°C)

  3 Steriler Arbeitsbereich

  Werkbank, Brutschrank, Wasserbad, Zentrifuge, Mikroskop, Stauraum, Gas-, Wasser-, Elektroanschlüsse
• Was ist die Steriltechnik?

  Arbeitsverfahren zur Vermeidung von Kontaminationen mit unerwünschten Mikroorganismen und Viren

  Bakterien, Mycoplasmen, Hefen und Pilze, Viren, Kreuzkontaminationen mit anderen Zellen
• Was sind Quellen der Kontamination?

  Mensch

  Kontaminierte Zellkulturen

  Gerätschaften

  Medien

  Reagenzien

  Luft

  Glaswaren, Pipetten

  Medien, Reagenzien
• Wichtige Verhaltens-Grundregeln steriler Arbeitstechniken?

  Hände waschen u/o desinfizieren

  Handschuhe

  aufgeräumte Arbeitsflächen

  Kulturen vor Arbeitsbeginn auf Sterilität kontrollieren

  Geräte und Flaschen außen mit 70%igem Alkohol desinfizieren

  nie über offenen sterilen Flaschen/ Schalen hantieren

  nach berühren mit unsterilen Stellen -> neue Glaswaren etc verwenden (Notbehelf: Abflammen)

  verschüttete Lösungen sofort mit alkoholgetränktem Tuch aufwischen

  Schütten von Flüssigkeiten vermeiden (Kontamination des Schalenrandes)
• Welche Anfoderungen gibt es an Desinfektionsmittel?


  schnelle und gründliche Keimreduktion

  gute Verträglichkeit mit Haut, Schleimhaut, Wunden, Materialien

  geringe Geruchsentwicklung

  lange Haltbarkeit

  gute Umweltverträglichkeit (biolog. abbaubar)

  geringe systemische Toxizität

  möglichst wenig Wirkungseinbuße durch Eiweiß oder Seifen

  ausreichende Eindringtiefe

  keine verbleibende Rückstände
• Welche Wirkungen sollen Desinfektionsmittel haben?

  Auflösen der Zellmembran

  Quervernetzung von Proteinen

  DNA-Strangbrüche

  Dehydration

  Denaturierung

  Oxidierung von zellulären Bestandteilen

  enzymhemmend
• Methode Desinfektion mit Ultraviolettem Licht


  Verminderung der Keimzahl

  Wirkungsoptimum 254 nm

  Absorptionsmaximum für Nucleinsäuren -> Bildung von Thymin-Dimeren

  Wirkzeit: 30 min

  Ausschalten der UV-Lampe vor Arbeitsbeginn

  ansonsten Verbrennungen der Augen und DNA-Schädigungen
• Welche Sterilisationsmaßnahmen gibt es?

  Autoklav: 15 min, 121°C, 200kPa (2bar), feucht

  Heißluftsterilisation: 30 min, 180°C, trocken

  Sterilfiltration: Verwendung von Sterilfiltern

  Gassterilisation: Ethylenoxid -> Alkylierung von Proteinen und Nucleinsäuren bei wärmeempfindlichen Gerätschaften

  Ionen-Plasma-Sterilisation: H2O2 in inertem Stickstoffplasma zur Oberflächensterilisation
• Was kann man zum Autoklav sagen? Teil 1 von 2

  
  

  • Dauer: 15 min, Wasserdampf, 121°C, 200kPa (2bar)
  • Glasflaschen zu 2/3 mit der zu sterilisierenden Lösung füllen, Schraubverschlüsse locker aufsetzen, damit kein Überdruck entsteht
  • leeren Flaschen, die mit Verschluss autoklaviert werden, sollte ebenfalls der Verschluss nicht ganz dicht aufgesetzt werden
  • jede Flasche mit Sterilisationsetikett bekleben
  • Flaschen gleichmäßig auf Einlageblech aufstellen
• Was kann man zum Autoklav sagen? Teil 2 von 2

  • Temperaturfühler des Autoklaven in ein Referenzgefäß hängen, dessen Waserinhalt dem des größten einzelnen Flüssigkeitsvolumen des Sterilisierguts entspricht
  • Tür des Autoklavs schließen, jeweiliges Programm starten
  • nach Beendigung der Sterilisation Etiketten auf korrekten Farbumschlag prüfen
  • Flaschen herausnehmen und auf nicht wärmeleitender Unterlage auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Erst danach Flaschen fest verschrauben
• Was ist Heißluftsterilisation?

  • trockene Hitze
  • geeignet für alle Materialien, die trocken bleiben müssen
  • Anheizzeit, Ausgleichzeit, Sterilisierzeit, Abkühlzeit

  160 °C mind. 180 min

  170°C mind. 120 min

  180°C mind. 30 min
• Welche Werkbankarten gibt es generell?


  1. Werkbank mit horizontaler Luftströmung I
  2. Sicherheitswerkbank nach Klasse I
  3. Sicherheitswerkbank nach Klasse II
  4. Sicherheitswerkbank nach Klasse III
• Werkbank mit horizontaler Luftströmung I?

  • sterile Luft über Arbeitsfläche
  • High Efficiency Particular Airfilter: HEPA-Filter -> Wartung
  • kein Personenschutz
  • kein Arbeiten mit Gefährdungspotential
  • z.B. für Präparationen und Ansetzen von Medien
  • Wartungsraum, preisgünstig
• Sicherheitswerkbank nach Klasse I?

  • Ansaugen der Raumluft durch Arbeitsöffnung über die Arbeitsfläche
  • Absaugen freigesetzter Aerosole und Partikel
  • Personenschutz mit Ausnahme der Hände und Arme
  • kein Schutz der Arbeitsgegenstände vor Kontaminationen
• Sicherheitswerkbank nach Klasse II?

  • sterile Verdrängungsströmung von oben nach unten
  • Ansaugen und FIltern von Raumluft
  • vorgeschriebene Luftströmung von >0,4 m/s am Lufteintrittsblech (vorne)
  • Verhinderung des Eintritts von Raumluft in sterilen Arbeitsbereich
  • kein Austritt von freigesetzten Aerosole und Partikeln
  • Produktschutz
  • Personenschutz mit Ausnahme der Hände und Arme
• Sicherheitswerkbank nach Klasse III?

  • Arbeiten mit Organismen und Viren der Risikogruppe 4
  • geschlossenen Experimentierraum
  • Materialschleuse
  • Unterdruck von >150 Pa
  • fest montierte Hanschuhärmel
  • Personenschutz
  • Benutzung weiterer Handschuhe zum Cross-Kontaminationsschutz möglich
  • Substanzpenetration durch Handschuhe
• Welche Ausstattung hat eine sterile Werkbank allgemein?

  • Vakuumanschluss
  • UV-Lampe
  • Steckdosen
  • Arbeitsplatte aus Edelstahl
  • Auffangbecken (Reinigung!)
  • Bunsenbrenner
• Wie arbeitet man an sterilen Werkbänken? Teil 1 von 2

  • 10 min. Vorlaufzeit der Werkbänke
  • Desinfizieren aller Oberflächen mit 70%igem EtOH
  • kein Zustellen der Einlassöffnung
  • spezielle Anordnung der Arbeitsmaterialien
  • kein Überstreichen von offenen Flaschen
• Wie arbeitet man an sterilen Werkbänken? Teil 2 von 2

  • kein Berühren steriler Arbeitsmaterialien mit Oberflächen von FLaschen o.ä.
  • kein Dauerbetrieb der Werkbank
  • Fenster und Türen bleiben geschlossen
  • nicht sprechen
  • niesen vermeiden
• Wozu Brutschränke?

  Nachahmung der in vivo Bedingungen

  -> konstante Temperatur

  -> konstanter pH

  nie mit frisch desinfizierten Händen hineingreifen!!!
• Was ist die optimale Ausstattung von einem Brutschrank?

  • Raumbefeuchtung
  • Kupferblech (bakterizid und fungizid)
  • Innenluftfilter
  • Selbstreinigung
  • Türheizung
  • Gaszufuhr (O2 oder N2)
  • geteilte Glastüren
  • Gaswächter für Versorgungsflaschen
• Identifikationen von Kontaminationen?

  • Bakterien: runde oder stäbchenförmige Partikel, Brownsche Molekularbewegung, Gelbfärbung bzw. Trübung des Mediums
  • Mycoplasmen: zunächst nicht zu identifizieren
  • Hefen: größer als Bakterien
  • Pilze: watteähnliche Erscheinung, Verbreitung über die Luft
  • Kreuzkontaminationen
• Nenne die 3 Gefahren in einer Zellkultur?

  • biologische Gefahren
  • chemische Gefahren
  • physikalische Gefahren
• Was ist das Ziel der Zellkulturtechnik?

  Angleich der in vitro Situation auf die in vivo Situation

  
• Was ist das besondere an Alkohol als Desinfektionsmittel?

  • schnelle Reaktionsgeschwindigkeit
  • wirksam in allen pH-Bereichen
  • wirksam bei:
  • vegetativen gram positiven Bakterien
  • Mykobakterien
  • gram. negativen Bakterien
  • Hefen und Schimmelpilzen (mäßig wirksam)
  • Viren (selektiv wirksam)
  • nicht wirksam: Sporen
  • geringe Beeinflussung durch das Mileu
  • Alkohol desinfiziert, aber sterilisiert nicht
• Was weißt du allgemein über Bakterien?

  • Gram positive und negative Bakterien
  • durchschn. Verdopplungszeit: 20 min
  • makroskopisch und mikroskopisch leicht zu identifizieren
  • trübes Medium
  • Farbumschlag des Mediums aufgrund des sich verändernden pH-Wertes
• Wie ist der Übertragungszeit von Bakterien und wie kann die Kontamination vermieden werden?

  Luft, Tröpfchen, Kontakt, Hautschuppen, Flaschenöffnung

  • wenig Publikumsverkehr
  • nicht unter der Werkbank reden
  • nicht über geöffneten Flaschen hantieren
  • Niesen und Husten vermeiden

  Ausweg: Auf Suche nach Kontamination gehen und alles Wegschmeißen, Verwendung von Antibiotika
• Was weißt du über Mycoplasmen?

  • selbst replizierende Prokaryoten; Parasiten für Menschen, Tiere und Pflanzen
  • Größe: 0,2-2 µm -> passieren Sterilfilter mit einer Größe von 0,2 µm
  • Übertragungsweg: Luft, Tröpfchen, Kontakt, im Tier selbst, Serum
  • Vermeidung einer Kontamination durch Sterilfiltration mit anorganischen Filtermembran mit einer Porengröße um 0,1 µm (nicht geeignet z.B. für proteinhaltige Lösungen)
  • nicht direkt sichtbar
• Nenne die ersten 7 Cytotoxischen Effekte durch Mycoplasmenkontamination?


  • Beeinträchtigung des Zellwachstums, der Proliferation und Vitalität
  • Einfluss auf Zellzyklus und Mitose
  • Verschiebungen im Aminosäuregleichgewicht des Kulturmediums durch Arginin-Depletion
  • Störungen des Aminosäure- und Nucleinsäurestoffwechsels
  • Änderungen in der Stoffwechselaktivität der Zellen
  • Verminderte Syntheseraten von DNA, RNA und Proteinen
  • Veränderte Genexpression
• Nenne 7 weitere (7-14) Punkte für cytotoxische Effekte durch Mycoplasmenkontaminationen?

  • Störungen in der Histonsynthese
  • Induktion von Chromosomenaberrationen
  • Modulation der zellulären Cytokinproduktion
  • Einfluss auf die Virusvermehrung
  • Reduzierte Tranfektionseffizienz
  • Interferenz mit versch. biochem. Assays
  • Beeinträchtigung der HAT-Selektion von Fusionshybriden
• Wie kann man Mycoplasmen nachweisen?

  • im ersten Moment nicht sichtbar
  • mittels DAPI-Färbung
• Was sind biologische Arbeitsstoffe für Risikogruppe 1?

  Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen.
• Was sind biologische Arbeitsstoffe für Risikogruppe 2?

  Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für Beschäftigte darstellen können;

  eine Verbreitung des Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich;

  eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise möglich.
• Was sind biologische Arbeitsstoffe für Risikogruppe 3?

  Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen können;

  die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung kann bestehen, doch ist normalerweise eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung möglich.
• Was sind biologische Arbeitsstoffe für Risikogruppe 4?

  Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen; die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung ist unter Umständen groß; normalerweise ist eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung nicht möglich.
• Wie ist die Gefährdungsbeurteilung von Zellkulturen?

  Zellkulturen sind biologische Arbeitsstoffe im Sinne der BioStoffV. Sie werden grundsätzlich in die Risikogruppe 1 eingestuft, da von den kultivierten eukaryotischen Zellen selbst keine Infektionsgefährdung ausgeht, auch nicht bei Tumorzellkulturen, wie sich beim langjährigen Umgang gezeigt hat.

  Allerdings können Zellkulturen zusätzliche biologische Arbeitsstoffe einer höheren Risikogruppe enthalten, die zu einer höheren Schutzstufe führen können.