Viro

• Thérapie génique

  • Peut concerner les cellules germinales ou cellules somatiques
  • Introduction de séquences codantes à fins thérapeutiques ou vaccinales
  • Séquence introduite: action corrective, ou nouvelle fonction
  • Le transfert de gène peut se faire in vivo ou ex vivo

  
• La thérapie génique a été utilisée avec succès pour corriger des immunodéficiences et autre maladies génétiques héritables
• Il y a une explosion en cours de techniques de modifications géniques de lymphocytes pour exprimer de nouveaux récepteurs immuns: les « CAR T cells »
• Les virus sont les principaux vecteurs utilisés pour le transfert de gènes

  
• Tout comme les autres biotechnologies, la thérapie génique s'est développée principalement aux USA
• La Chine va rapidement devenir le leader mondial en thérapie génique grâce aux essais cliniques sur les « CAR T cells »
• Choix des pathologies ciblées en thérapie génique

  • Maladies héréditaires monogéniques récessives
  • Cellules cancéreuses: multiples opportunités de tuer ces cellules sélectivement, et essor actuel de l'approche « CAR T cell »
  • Sites plus aisés d'accès: sang, foie, yeux
  • Relativement faible représentation des maladies neurologiques et des maladies infectieuses
• Les thérapies géniques approuvées aux USA et en Europe ciblent principalement les cancers sanguins
• Coût d'un traitement par thérapie génique

  • Comparable à une intervention de chirurgie, et non à un traitement pharmacologique
  • Les coûts de développement d'une nouvelle thérapie génique sont estimés à plusieurs centaines de millions $
• Thérapies géniques approuvées

  • Glybera (1 M$)
  • Thérapie génique de l'amaurose congénitale de Leber
  • Strimvelis (SCID-ADA)
• Objectifs à accomplir pour le transfert de gènes avec des vecteurs viraux

  • Remplacement de gènes du virus par le gène d'intérêt
  • Conservation des séquences « cis » pour l'encapsidation, la réplication, et l'expression génique
  • Possibilité et bénéfice de fournir un promoteur (ne provenant pas du virus) dirigeant l'expression du transgène
  • Dans la plupart des cas, aucun gène viral n'est exprimé

  
• Propriétés des principaux vecteurs viraux

  • Adénovirus: taille maximale disponible variable
  • Rétrovirus et lentivirus: système de production à 3 plasmides
  • AAV: nécessité d'un adénovirus pour la réplication et l'intégration

  
• Le déclin des vecteurs adénoviraux est dû au premier décès dans un test clinique de thérapie génique en 1999, causé par une réponse inflammatoire massive
• Les vecteurs lentiviraux ont une préférence pour les séquences transcrites mais pas spécialement pour le site d'initiation, contrairement aux vecteurs oncorétroviraux
• À long terme, certains promoteurs non humains ont tendance à être inactivés dans des cellules humaines par méthylation
• Le contrôle du tropisme des vecteurs dérivés du AAV est possible
• Entrée des virus enveloppés

  1. Fusion entre l'enveloppe du virion et la membrane plasmique de la cellule infectée

  2. Fusion entre l'enveloppe du virion et la membrane de la vésicule d'endocytose
• Fusion

  1. La fusion se fait entre la membrane du virus et celle de l'endocytose

  2. Le signal de fusion est l'acidification du pH
• Étapes de l'entrée d'un virus dans une cellule

  1. Initiation de l'infection: une collision due au hasard

  2. Adhérence des virus à la surface cellulaire par électrostatisme, non spécifique

  3. Attachement par interaction avec des récepteurs spécifiques

  4. Un virus peut se lier à plus d'un récepteur sur la même cellule

  5. Plusieurs virus peuvent avoir le même récepteur

  
• Fusion

  1. Des modifications structurales radicales vont avoir lieu, qui vont amener les peptides de fusion en contact avec la membrane plasmique de la cellule ciblée

  2. L'effondrement de cet intermédiaire va rapprocher les deux bicouches lipidiques

  3. La fusion passe par une étape intermédiaire d'hémifusion
• Fusion du VIH

  1. gp120 va interagir simultanément avec deux protéines

  2. Cette interaction va conduire à la réorganisation de gp41 et l'insertion des peptides de fusion dans la membrane plasmique de la cellule
• Fusion des virus enveloppés entrant par endocytose

  1. La fusion se produit au moment de l'acidification des vésicules d'endocytose

  2. L'acidification contribue à la réorganisation structurale des protéines de surface

  
• gp41

  Protéine de surface du VIH-1
• gp120

  Protéine de surface du VIH-1
• gp120

  • Va interagir simultanément avec deux protéines
  • Cette interaction va conduire à la réorganisation de gp41 et l'insertion des peptides de fusion dans la membrane plasmique de la cellule
• L'étape de fusion est une cible récente pour des composés anti-VIH
• Déploiement, insertion et repliement de gp41

  1. Le repliement nécessite les hélice alpha c et n terminal

  2. On veut des molécules qui empêchent ce repliement pour bloquer la fusion
• Fusion des virus enveloppés entrant par endocytose

  • La fusion se produit au moment de l'acidification des vésicules d'endocytose
  • L'acidification contribue à la réorganisation structurale des protéines de surface

  
• Exemple du TBEV (tick-borne encephalitis virus)

  • Protéines de surface présentes sous forme de dimères
  • Peptides de fusion cachés dans l'interface
  • L'acidification défait les dimères
  • Trimérisation

  
• Exemple du influenza (classe I)

  • Site d'interaction avec l'acide sialique
  • Fusion induite par l'acidification
• La bicouche lipidique des virions de virus enveloppés provient de membranes cellulaires
• Les génomes viraux n'ont pas de gènes pour la synthèse lipidique; ils dépendent donc entièrement de leur hôte cellulaire pour la synthèse de leur membrane
• Sortie des virus enveloppés

  • L'assemblage de la capside peut se faire indépendamment de la membrane
  • Le relarguage du virion nécessite des interactions entre protéines du cœur viral et la membrane plasmique
  • Des protéines virales peuvent parfois être modifiées par des acides gras, facilitant leur ancrage dans les membranes cellulaires
  • L'incorporation des protéines virales d'enveloppe peut se faire avec ou sans l'aide d'interactions spécifiques entre ces protéines et les protéines du cœur viral

  
• Bourgeonnement des virus enveloppés: cas des herpesviridae

  • Assemblage dans le noyau
  • Première étape d'enveloppement au niveau de la membrane nucléaire
  • Acquisition de l'enveloppe définitive au niveau de vésicules associées à l'appareil de golgi
  • Fusion de la vésicule avec la membrane plasmique pour libérer le virion

  
• Corps multivésiculaires

  • Système d'élimination de protéines et lipides ubiquitinylés
  • Micro-domaines au sein de larges vésicules endosomales appartenant à l'endosome précoce
  • Petites vésicules qui vont bourgeonner au sein d'autres larges vésicules appartenant à l'endosome tardif
• Late domains viraux

  Motifs protéiques très courts présents dans les protéines de structure et nécessaires au bourgeonnement du virus
• Rôle des complexes ESCRT dans le bourgeonnement des virus enveloppés

  • Normalement recrutés au niveau des membranes endosomales
  • Détournés vers les sites d'assemblage viral par les motifs courts présents dans les protéines virales (« late motifs »)
  • Libération ultime du virion

  
• Tsg101, Alix, Nedd4-like Ub ligase

  Interagissent avec les « late domains » viraux
• Lorsque les late domains sont mutés, les virus sont assemblés et commencent à bourgeonner mais le relarguage n'a pas lieu
• Les complexes ESCRT-I (marqueur: Tsg101) sont incorporés en grand nombre dans chaque virion en formation