Biología celular II

• Primers

  Secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta
• Primers


  • Tamaño oscila entre 15-25 pares de bases
  • Cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia
• Si no se respetan las reglas de los primers

  Existe la posibilidad de la formación de dímeros de primers, es decir, de productos inespecíficos
• Formación de dímeros de primers

  Repercutiría en el rendimiento de la reacción, así como en la especificidad del producto esperado
• Forward primer


  Secuencia de primer en sentido
• Reward primer


  Secuencia de primer en antisentido
• Ambas secuencias de primers deben estar diseñadas para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5'-3
• Hay laboratorios de biología molecular que se dedican a diseñarlos, sintetizarlos y validarlos para garantizar su especificidad, facilitándole el trabajo al usuario que sólo elige el de su interés y los manda a comprar
• Una de sus aplicaciones de la PCR más usadas es para cuantificar cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles del ARNm procedente de células o tejidos. La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas a diferencia de la PCR, punto final que necesita una mayor concentración.
• Análisis de la reacción

  1. Detectar la amplificación en tiempo real

  2. Capturar la fluorescencia de cada muestra

  3. Generar gráficas con datos necesarios para conocer si la reacción fue exitosa

  4. Elegir el tipo de cuantificación a usar
• Gráfica de amplificación


  Muestra el curso y el progreso de la reacción
• Curva de disociación o curva melting


  Muestra información sobre la especificidad de la reacción
• Tipos de cuantificación

  • Cuantificación absoluta
  • Cuantificación relativa
• Cuantificación absoluta


  Se utiliza para conocer el número exacto de copias amplificadas del blanco o la concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra
• Cuantificación relativa


  Se aplica cuando se desean evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos, comparando con un gen de referencia
• Los datos de cuantificación relativa son expresados como relativos al gen de referencia y generalmente son referidos como el número de veces en el que aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm o en su caso, si no hubo cambios
• Casi todos los software de los equipos están posibilitados para llevar a cabo los análisis matemáticos y estadísticos que se requieren en cada tipo de cuantificación
• En la etapa de extensión de la PCR, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.
• Métodos no específicos

  Basados en el uso de moléculas intercalantes que tienen afinidad por el ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una señal fluorescente
• Fluorescencia emitida


  1. Capturada en la etapa de extensión de cada ciclo

  2. Proporcional al número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR
• SYBR Green


  • Molécula cargada positivamente que, mientras esté en solución sin unirse al ADN de doble cadena, prácticamente no emite fluorescencia
  • Cuando se une al surco menor del ADN incrementa hasta 1,000 veces su fluorescencia
• SBYR Green es uno de los reporteros fluorescentes más utilizados por los investigadores debido a su bajo costo
• La principal desventaja del SBYR Green es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble cadena, incluyendo dímeros de primers
• Curva melting o curva de disociación


  1. Realizada al final de la reacción

  2. Evalúa si se formó un producto único o si hay presencia de dímeros de primers
• Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa.
• En la fase de hibridación de la PCR, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente..
• Electroforesis


  Separación de grandes moléculas como los ácidos nucleicos a través de una matriz sólida que funciona como un filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica
• Proceso de electroforesis

  1. Preparar un gel diluyendo agarosa en un buffer

  2. Calentar hasta que la agarosa hierva

  3. Vaciar a un recipiente para que solidifique

  4. Agregar bromuro de etidio al gel

  5. Cargar los amplicones junto con un marcador molecular

  6. Visualizar los amplicones exponiendo el gel a luz UV y tomar una foto digital
• Gel de electroforesis

  • Generalmente se prepara al 1.2%, pero puede ser hasta el 2% dependiendo del tamaño de las moléculas
  • Contiene bromuro de etidio, un compuesto mutagénico y teratógeno que se une al ADN y emite señal con luz UV
• Marcador molecular

  Contiene un número determinado de segmentos de ADN conocidos, facilita la identificación del tamaño de los amplicones
• El tamaño de los amplicones está dado por el número de pares de bases
• La electroforesis se usa para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica
• Métodos específicos


  • Parten de principios distintos a los no específicos
  • Tienen en común la señal de fluorescencia emitida para detectar los productos amplificados
• FRET (Transferencia de energía de resonancia fluorescente)


  Método que consiste en transferir energía desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor o «quencher»
• Pruebas basadas en hidrólisis

  1. Sondas fluorescentes de oligonucleótidos etiquetados con un reportero fluorescente y un «quencher» se encuentran en estrecha unión

  2. Cuando la sonda hibrida, ocurren cambios conformacionales en el reportero y el quencher

  3. La actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq polimerasa rompe esta unión

  4. La fluorescencia emitida por el reportero es liberada y capturada por el equipo
• Pruebas basadas en hidrólisis

  • Son muy seguras
  • Mientras no haya unión de la sonda a su blanco, no habrá amplificación y tampoco señal de fluorescencia
  • La especificidad es muy alta
• La PCR es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células.
• PCR en tiempo real

  Los ingredientes químicos son los mismos utilizados en la PCR punto final
• Composición de la Master mix


  1. Enzima

  2. dNTP's

  3. Mg+

  4. Buffer

  5. Sistema reportero de fluorescencia para detectar los productos amplificados

  6. Agua es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas

  7. Primers
• Primers


  • Deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta especificidad
  • Deben generar amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb
  • Si los amplicones son más grandes, la eficiencia de la reacción disminuye considerablemente