Biokemija

• Podvojevanje in prepisovanje DNA


  1. Prevajanje RNA

  2. Sinteza proteinov

  
• Genom


  Celotna količina genetske informacije določene celice, ki je shranjena v DNA
• Prenos in izražanje biološke informacije


  1. Podvojevanje DNA

  2. Sinteza RNA

  3. Sinteza proteinov

  
• Celična zgradba in funkcija


  • Metabolizem, ki nam daje energijo
  • Sinteza in razgradnja biomolekul
  • Shranjevanje in transport biomolekul
  • Celična komunikacija (prenos signalov)
• Podvojevanje DNA


  • Samousmerjevalen proces
  • Semikonzervativna replikacija; vsaka od obeh dvoverižnih molekul DNA sestavljena iz 1 starševske in 1 nove hčerinske verige
  • Začne se na točno določenih mestih DNA (podvojevalne ali replikacijske vilice)

  
• Podvojevanje DNA (DNA ® DNA)


  1. Več izhodišč podvojevanja; ob vsakem nastane par podvojevalnih vilic

  2. Dvoje vilic napreduje v nasprotnih smereh

  3. Dobimo 2 molekuli dvoverižne DNA

  4. Prepiše se celotna molekula DNA
• Podvojevanje evkariontske DNA


  1. Vsak nukleotid se preko baze najprej poveže s H-vezmi in van der Waalsovimi silami s komplementarno bazo na matrici

  2. DNA-polimeraza katalizira kovalentno povezavo tega nukleotida s predhodnim nukleotidom na rastoči verigi

  
• Bazni pari


  1. T, G-C
• Podvojevanje DNA - replikacija; osnovni princip


  1. Veriga se mora odviti in razpreti

  2. Enojno verigo moramo stabilizirati

  3. Potrebujemo primer (RNA), da se lahko sinteza nekje začne

  4. Encim, ki bo dodajal nukleotide

  5. RNA primer moramo zamenjati z DNA

  6. Zlepiti zamenjano DNA s preostalo verigo

  
• Podvojevanje DNA - celoten aparat in postopek


  1. Veriga se mora odviti in razpreti; topoizomeraza pomaga odviti verigo, helikaza razpre DNA, tako da prekine H-vezi med bazami

  2. Enojno verigo moramo stabilizirati; vežejo se proteini SSB (single-strand binding)

  3. Potrebujemo primer (RNA), da se lahko sinteza nekje začne; sintezo primerja katalizira primaza

  4. Encim, ki bo dodajal nukleotide; DNA-polimeraza III

  5. RNA primer moramo zamenjati z DNA; DNA-polimeraza I

  6. Zlepiti zamenjano DNA s preostalo verigo; DNA-ligaza

  
• Podvojevanje poteka, tako, da se nukleotidi dodajajo na 3'-konec verige à veriga raste od 5'-konca proti 3'-koncu
• Glede na komplementarni – matrični verigi gre torej ravno obratno

  
• Vodilna veriga


  Odprta na 3'-koncu
• Zastajajoča veriga


  Odprta na 5'-koncu, sintetizira se po delih, dolgih 1000 - 2000 nukleotidov, ki jih imenujemo Okazakijevi fragmenti
• Centralna dogma molekularne biologije: DNA ® RNA: prepisovanje oz. transkripcija, RNA ® Proteini: prevajanje

  
• Prepisovanje oz. transkripcija


  1. Matrična veriga: veriga dvoverižne DNA, ki se uporabi za sintezo RNA, bere se v smeri 3'®5'

  2. Prepis ali transkript: RNA, ki nastaja v smeri 5'®3'

  3. Novo verigo sintetizira encim RNA-polimeraza

  
• Sinteza RNA


  1. Začetek (iniciacija): RNA-polimeraza poišče vezavno mesto na matrici DNA (promotorska regija)

  2. Podaljševanje (elongacija)

  3. Zaključek (terminacija): posebna zaporedja DNA

  
• Promotorske regije


  Zaporedja z značilno sestavo, ki se nahajajo na točno določenih mestih pred mestom začetka prepisovanja DNA v RNA
• Antibiotiki lahko inhibirajo transkripcijo: rifamicini inhibirajo iniciacijo (tvorbo 1. fosfodiestrske povezave) s tem, da se veže na ß-podenoto, aktinomicin se veže na dsDNA in preprečuje razvitje in uporabo kot matrica
• inja


  DNA ®RNA: prepisovanje oz. transkripcija
• Prenos informacije na RNA


  1. Matrična veriga: veriga dvoverižne DNA, ki se uporabi za sintezo RNA, bere se v smeri 3'®5'

  2. Prepis ali transkript: RNA, ki nastaja v smeri 5'®3'

  3. Novo verigo sintetizira encim RNA-polimeraza

  
• Tehnologija rekombinantne DNA


  Molekulsko kloniranje = rekombinacija DNA: kovalentna vključitev fragmenta DNA iz ene vrste celic ali organizma v DNA druge vrste

  
• Sinteza RNA pri prokariontih
• Primer proizvodnje inzulina v bakterijah


  1. Poiščemo DNA zapis za protein inzulin

  2. Vstavimo ga v vektor, ki omogoča, da se bo zapis podvojeval, prepisoval in na koncu izražal v bakterijah

  3. Bakterije, ki sedaj proizvajajo inzulin namnožimo v bioreaktorju

  4. Iz suspenzije celic izoliramo inzulin
• Antibiotiki


  • Rifamicini inhibirajo iniciacijo (tvorbo 1. fosfodiestrske povezave) s tem, da se veže na ß-podenoto
  • Aktinomicin se veže na dsDNA in preprečuje razvitje in uporabo kot matrico
• Na novo sintetizirane molekule RNA (primarni transkripti) običajno niso biološko aktivne, temveč se morajo pred tem obdelati

  
• Gensko spreminjanje organizmov


  Molekulsko kloniranje = rekombinacija DNA: kovalentna vključitev fragmenta DNA iz ene vrste celic ali organizma v DNA druge vrste
• Molekulsko kloniranje


  • Kloniranje DNA: prejemniška celica se deli in njene potomke proizvedejo več kopij hibridne DNA
  • Proizvodnja večjih količin proteinov: fragment z zapisom za nek protein vstavimo navzdol od promotorske regije – gostiteljske celice proizvajajo kopije tega zapisa in proteina

  
• Tehnike molekularne genetike (koraki pri delu)


  • Izolacija DNA
  • Po/Na-množevanje DNA
  • Vstavljanje DNA v tarčni vektor
  • Vizualizacija DNA

  
• Izolacija DNA


  1. DNA moramo dobiti ven iz (jeder) celic, pri čemer se želimo znebiti ostalih snovi, predvsem tistih, ki bi lahko motile nadaljnje korake

  2. Razbitju rečemo liza celic ali pa homogenizacija

  3. Paziti moramo, da se DNA vmes ne poškoduje (inhibicja DNAz)

  4. Izbira metode je odvisna od vrste izhodnega materiala (vrste celic)

  
• Zorenje tRNA


  1. Ukrajšanje koncev s cepitvijo fosfoestrskih vezi

  2. Izrezovanje introna

  3. Dodajanje končnih zaporedij

  4. Spreminjanje heterocikličnih baz

  
• Zorenje rRNA


  1. Rezanje prekurzorja (izrezovanje intronov)

  2. Metiliranje baz
• Metode za lizo celic oz. homogenizacijo


  • Prosojnica je iz seminarjev pri predmetu Biokemijski praktikum (avtor: doc. dr. Miha Pavšič)

  
• Prokarionti


  Geni brez presledkov in prekinitev
• Evkarionti


  Prepiše se le del informacije, ki jo nosi DNA; kodirajoče regije oz. enote: geni
• Zorenje mRNA pri evkariontih


  1. Dodajanje kape na 5'-koncu verige

  2. Dodajanje 3' poliA repa

  3. Izrezovanje intronov oz. splicing
• Virusi v gostiteljskih celicah inducirajo sintezo encima RNA-polimeraza, ki jo usmerja RNA (RNA-replikaza)

  
• Edina razlika med sintezo, ki jo usmerja DNA, in tisto, ki jo usmerja RNA, je, da RNA-replikaza potrebuje enoverižno matrico RNA

  
• Centralna dogma molekularne biologije


  • Prepisovanje
  • Prevajanje
• Sinteza proteinov


  • 3 nukleotidi določajo 1 AK
  • Kodoni se ne prekrivajo, ni presledkov
  • Genetski kod je univerzalen in degeneriran
  • mRNA se prevede od 5'-konca proti 3'-koncu
  • Polipeptidna veriga se sintetizira od N-konca proti C-koncu