Εργαστηριο

• Θρεπτικά υποστρώματα ή θρεπτικά υλικά

  Τεχνητά υλικά τα οποία χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια μικροβίων στο εργαστήριο
• Τα θρεπτικά υποστρώματα ανάλογα με την υφή τους:

  Υγρά, Στερεά, Ημίρρευστα
• Ανάλογα με τη σύστασή τους:

  Καθορισμένα, Σύνθετα , Εμπλουτισμένα, Επιλεκτικά
• ετερότροφους οργανισμούς:

  -πηγή ενέργειας : (συνήθως ένα σάκχαρο), μια πηγή αζώτου, βιταμίνες και διάφορα ανόργανα άλατα
• αυτότροφους οργανισμούς:

  • κύρια ή αποκλειστικά, ανόργανα άλατα
• Πεπτόνη

  Κύρια πηγή αζώτου για τα μικρόβια

  Παράγεται από την εκχύλιση φυσικών προϊόντων πλούσιων σε πρωτεΐνες
• Άλατα, χρωμομετρικοί δείκτες


  
  

  Απαραίτητα για την ανάπτυξη μικροβίων

  Χρησιμοποιούνται επίσης για τη ρύθμιση του pH
• Σάκχαρα 


  Κύρια πηγή άνθρακα για τα περισσότερα ετερότροφα μικρόβια

  Χρησιμοποιούνται στη μελέτη βιοχημικών ιδιοτήτων των μικροβίων
• Εκχύλισμα κρέατος

  Παρασκευάζεται από άπαχο κρέας μετά από βρασμό

  Αποτελεί πηγή πρωτεϊνών, αλάτων και αυξητικών παραγόντων
• Αποστείρωση είναι η διαδικασία που απαλλάσσει τα θρεπτικά υλικά από κάθε ζωντανό κύτταρο, σπόριο ή ιό.

  Η αποστείρωση πραγματοποιείται σε αυτόκλειστο (autoclave) σε Τ=121oC (P=1 atm) για t= 20 min.
• Μετά την ολοκλήρωση της αποστείρωσης τα αποστειρωμένα υλικά αφήνονται να ψυχθούν και είναι έτοιμα προς χρήση.

  Συντηρούνται αναλλοίωτα σε σκοτεινό και δροσερό χώρο για μεγάλο χρονικό διάστημα
• Αναγνώριση (ταυτοποίηση) των βακτηρίων μιας αποικίας


  1. Συγκεκριμένες χρώσεις

  2. Βιοχημικοί έλεγχοι
• Καλλιεργητικά χαρακτηριστικά

  • Ανάπτυξη σε συγκεκριμένα θρεπτικά υλικά
  • Εξετάζονται οι συνθήκες ανάπτυξης
  • Εξετάζεται ο χρόνος επώασης
• Αντιγονικά χαρακτηριστικά


  • Έλεγχος της αντιγονικής σύστασης του κυττάρου
  • Ορολογική ταυτοποίηση
• Σύσταση γενετικού υλικού


  • Έλεγχος της ομολογίας στην αλληλουχία των βάσεων του γενετικού υλικού των μικροβίων
• Καθαρή καλλιέργεια είναι το σύνολο των κυττάρων που προέρχονται από ένα και μοναδικό μικροβιακό κύτταρο. Καθαρές καλλιέργειες δεν υπάρχουν στη φύση.
• Η αναγνώριση (ταυτοποίηση) των βακτηρίων μιας αποικίας, είναι διαδικασία πολύπλοκη και περιλαμβάνει συγκεκριμένες χρώσεις και βιοχημικούς ελέγχους
• Ο κανόνας είναι ότι οι μικροοργανισμοί ζουν στη φύση σε μεικτούς πληθυσμούς.

  Οι καθαρές καλλιέργειες είναι απαραίτητες για την επιστήμη της Μικροβιολογίας, αφού μόνο όταν υπάρχει ένα μικροβιακό στέλεχος σε καθαρή καλλιέργεια είναι δυνατόν να μελετηθεί στο εργαστήριο
• Μία από τις πιο σημαντικές χρώσεις της Μικροβιολογίας επειδή ταξινομεί τα βακτήρια σε δύο μεγάλες κατηγορίες : Gram (+) και Gram (-).
• Ολικό αριθμό βακτηριακών κυττάρων (ζωντανών και νεκρών)που προσδιορίζεται:

  1.Συνολικός αριθμός βακτηρίων:

  με άμεση εξέτσαση με οπτικό μικροσκόπιο

  έμμεση εξέταση με τη μέτρηση της θολερότητας του βακτιριακού εναιωρήματος

  
  

  2.Αριθμός ζώντων βακτηρίων

  Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων σε τρυβλία Petri
• Μέθοδος άμεσης εξέτασης με οπτικό μικροσκόπιο

  • Απλή, οικονομική και γρήγορη
  • Δίνει πληροφορίες για το μέγεθος και τη μορφολογία των μικροοργανισμών
• όσο μεγαλύτερη η θολερότητα της καλλιέργειας -> τόσο μεγαλύτερη η συγκέντρωση των κυττάρων , επομένως μικρότερη ποσότητα φωτός που τη διαπερνά
• Αλκαλικές Αποτελούνται από χρωμογόνο θετικό ιόν -αμμεση, χροματίζονται τα κύτταρα

  Όξινες Αποτελούνται από χρωμογόνο αρνητικό ιόν - έμμεση, χρωματίζεται το περιβάλλον του βακτηρίου
• 1.Παρασκεύασμα σε αντικειμενοφόρο πλάκα

  2.Μονιμοποίηση του παρασκευάσματος με ελαφρά θέρμανση σε φλόγα ή χημικά με αιθανόλη, μεθανόλη κ.α.(fixation)
• Ενζυμικές αντιδράσεις : Έλεγχος καταλάσης

  
  

  Ερμηνεία αποτελέσματος: Θετικό αποτέλεσμα (Παρουσία ενζύμου): εμφάνιση σε σύντομο χρονικό διάστημα φυσαλίδων λόγω του παραγόμενου οξυγόνου από τη διάσπαση του H2Ο2.

  Αρνητικό αποτέλεσμα (Απουσία ενζύμου): το παρασκεύασμα παραμένει ομοιογενές χωρίς το σχηματισμό φυσαλίδων.
• Ευαισθησία των μικροβίων στα αντιβιοτικά (Αντιβιόγραμμα):

  1. Ποσοτική (MIC-MBC)

  2. Ποιοτική Αντιβιόγραμμα

  Οι ζώνες αναστολής που έχουν σχηματιστεί αξιολογούνται και συγκρίνονται με ζώνες αναστολής πρότυπων βακτηρίων-μαρτύρων.
• Gram+ βακτήρια

  Βακτήρια με παχύ στρώμα πεπτιδογλυκάνης στο κυτταρικό τοίχωμα
• Gram- βακτήρια

  Βακτήρια με λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης στο κυτταρικό τοίχωμα
• Χρώση Gram+ και Gram- βακτηρίων

  1. Απομάκρυνση κυτταρικού τοιχώματος Gram+ βακτηρίων

  2. Προσθήκη αλκοόλης συστέλλει πόρους παχέως στρώματος πεπτιδογλυκάνης Gram+ βακτηρίων

  3. Διατήρηση συμπλόκου ιωδίου-κρυσταλλικού ιωδίου στα Gram+ βακτήρια

  4. Απομάκρυνση συμπλόκου ιωδίου-κρυσταλλικού ιωδίου στα Gram- βακτήρια λόγω μεγαλύτερων πόρων

  5. Χρώση Gram- βακτηρίων με ροζ αντιχρωστική
• Παχύ στρώμα πεπτιδογλυκάνης Gram+ βακτηρίων

  Μικρότεροι πόροι
• Λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης Gram- βακτηρίων

  Μεγαλύτεροι πόροι
• Προσθήκη αλκοόλης

  Απομάκρυνση λιποειδών και αύξηση μεγέθους πόρων Gram- βακτηρίων
• Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία της μεθόδου είναι οι ακόλουθοι:

  η πυκνότητα και η ποσότητα της καλλιέργειας που θα επιστρωθεί στο τρυβλίο

  ο χρόνος επώασης

  το πάχος του θρεπτικού μέσου

  η διάχυση του αντιβιοτικού

  η συγκέντρωση του αντιβιοτικού στον δίσκο

  ο ρυθμός ανάπτυξης του βακτηρίου στο συγκεκριμένο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας
• Άγαρ


  • Χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση 1-2% για τη μετατροπή των υγρών θρεπτικών υλικών σε στερεά
  • Δεν χρησιμοποιείται από τα μικρόβια ως θρεπτική ουσία
• Φωτομετρία


  1. Υπολογισμός συγκέντρωσης βακτηρίων σε καλλιέργεια

  2. Όσο μεγαλύτερος ο αριθμός των βακτηρίων, τόσο μεγαλύτερη η θολότητα της καλλιέργειας

  3. Μικρότερη η ποσότητα του φωτός που φτάνει στο φωτοευαίσθητο κύτταρο του φωτόμετρου
• Βιολογικά υλικά


  Περιλαμβάνουν αίμα, ορό αίματος
• Βιολογικά υλικά


  • Απαραίτητα για την ανάπτυξη ορισμένων απαιτητικών μικροβίων