Tema 5 1

• Métodos de estudio de la microbiota marina: técnicas no dependientes de cultivo


  • Microscopía
  • Citometría de Flujo
  • Técnicas de Hibridación In situ
  • Amplificación selectiva y Secuenciación: PCR; DGGE; Técnicas NGS de Secuenciación
  • Principios del Análisis Metagenómico
• El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm (200 µm) es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia
• El invento del microscopio se otorga a Zacharias Janssen


  1590
• Robert Hooke publicó el libro Micrographia con 50 observaciones microscópicas


  1665
• Robert Hooke llamó "célula" a la cavidad que dibujó en una lámina de corcho, similar a las celdas de un panal de abejas
• Leeuwenhoeck descubre la existencia de vida microbiana


  1676
• El más potente de los instrumentos de Leeuwenhoeck conservados hoy en día tiene una tasa de ampliación de 275 veces y un poder de resolución de 1,4 μm
• Leeuwenhoeck mantuvo en secreto sus métodos de fabricación de las lentes, y hubo que esperar varias décadas para disponer de nuevo de microscopios tan potentes
• Leeuwenhoeck: '"Hay más animáculos entre nuestros dientes que súbditos hubiere en todo un reino"'
• Microscopio óptico de campo claro


  • Fuente luminosa que ilumina la muestra
  • Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra
  • Platina sobre la cual se coloca la muestra
  • Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra
  • Ocular que recibe la imagen formada por el objetivo

  
• Tinción


  Proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a componentes celulares, permitiendo cambiar el color de las células y poder observarlas al microscopio

  
• Colorante


  Sustancia capaz de absorber determinadas longitudes de onda del espectro de luz, fijándose en otras y dotándolas de color de manera estable

  
• Tinción simple


  • Tinción con azul de metileno
  • Tinción negativa con rojo Congo
• Tinción diferencial


  Se basan en una tinción primaria, y posteriormente una tinción de contraste para teñir las células que no se hayan teñido previamente
• Tinción de Gram


  Método para diferenciar grandes grupos microbianos por microscopía en función de la distinta composición de su pared bacteriana

  
• Resultados de la tinción de Gram


  • Gram positivas
  • Gram negativas
• Pasos de la tinción de Gram

  1. Violeta de Genciana 3 min

  2. Mordiente Lugol 1 min

  3. Lavar dos veces con etanol 30 seg

  4. Tinción de contraste con Safranina 1 min
• Microscopía de fluorescencia


  Permite observar e identificar componentes celulares y biomoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, liposacáridos, etc)

  
• Fluorescencia


  Propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide luz de una longitud de onda determinada
• Microscopio de fluorescencia


  • Lámpara que emite luz en todo el espectro
  • Filtro de excitación que selecciona la parte del espectro de luz que va a incidir sobre la muestra
  • Espejo dicroico que refleja o deja pasar la luz según su longitud de onda
  • Filtro de barrera que selecciona exactamente el espectro de la luz emitida

  
• Diacetato de fluoresceína


  Marca células vivas: metabólicamente activas
• Yoduro de propidio


  Marca ADN de células muertas: con la membrana dañada
• Inmunofluorescencia


  Detección específica de antígenos con anticuerpos marcados con fluoróforos para la identificación de tipos celulares
• Hibridación in situ


  Detección específica de ácidos nucleicos con sondas marcadas con fluorocromos
• Anticuerpos


  Proteínas del sistema inmunológico también conocidas como inmunoglobulinas que se producen en respuesta a la presencia de moléculas extrañas en el cuerpo
• Antígenos


  Cualquier sustancia que sea capaz de provocar una respuesta inmune (por ejemplo, la producción de moléculas de anticuerpos específicas)
• La zona donde el antígeno se une al anticuerpo recibe el nombre de epítopo o determinante antigénico, mientras que el área correspondiente de la molécula del anticuerpo es el parátopo
• Bioconjugación de anticuerpos con fluorocromos


  Ester de succinimidilo (NHS) reaccionan eficazmente con grupos amino primarios (-NH₂) para formar enlaces amida covalentes estables