Lab

• Respeitar a separação de lixos e material sujo durante a aula, utilizando os contentores respetivos colocados na bancada
• Não escrever ou riscar as bancadas
• Evitar manter em cima da bancada objetos pessoais e/ou desnecessários ao funcionamento da aula
• Limpar a bancada no final de cada aula, incluindo a tina de lavagem se a utilizou (nomeadamente com corantes)
• No final de cada aula, colocar o material sujo e/ou contaminado nos recipientes gerais e o lixo no depósito da porta da tina de lavagem
• Manusear as micropipetas com cuidado e de acordo com os volumes a que se destinam
• No final da aula verificar que: os bicos de gás; os microscópios e as lupas; a centrífuga; os agitadores; o Spectronic e outros aparelhos ficam desligados; o material contaminado se encontra nos recipientes apropriados
• Pontas e Eppendofs


  Caixas com fita vermelha (material reutilizado); Caixas sem fita vermelha (material novo)
• As pontas e eppendorfs contaminados com fenol e/ou clorofórmio devem ser colocados no recipiente com tampa que se encontra na bancada, não sendo removidos no final da aula
• As luvas de latex e de plástico disponíveis nas duas bancadas devem ser utilizadas apenas quando estritamente necessário
• Utilize as micropipetas com os cuidados devidos, não as colocando em posição horizontal quando as pontas contêm líquido. Tenha particular atenção à micropipeta 0,5-10 µl, de modo a evitar a quebra da sua ponta que é muito frágil
• Os suportes existentes são para utilização durante a aula prática, devendo ser colocados nos sítios apropriados no final da aula
• Lavar sempre as mãos no início e no final da aula. Cabelos compridos devem ser presos (por contacto próximo da chama)
• Calor seco


  Utilização do Bico de Bunsen para esterilizar agulhas e a boca dos tubos. O calor seco também pode ser fornecido por uma estufa (a elevadas temperaturas), ou até pela água a ferver
• Flamejamento


  Método temporário para eliminar qualquer microrganismo num determinado local, por exemplo, após a inoculação fazer-se o flamejamento da boca do tubo com o bico de Bunsen, durante um curto período
• Incineração


  Método utilizado principalmente nas ansas, antes e após elas entrarem em contacto com os microrganismos. Reduz a cinzas o material biológico desses microrganismos contido no material
• Irradiação


  Método utilizado principalmente com material que não suporta altas temperaturas, como o plástico. Pode ser utilizada a radiação gama ou a radiação ultravioleta
• Calor húmido


  Os meios de cultura são esterilizados por calor húmido que nos é fornecido por um equipamento, a autoclave
• Filtração


  Método de esterilização mecânico que retém os microrganismos num filtro, utilizado para meios de cultura termosensíveis
• Meio de cultura


  Substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico natural
• O solvente dos meios de cultura que utilizamos em laboratório é a água destilada
• Os meios de cultura também têm de estar esterilizados
• Ágar


  Polissacarídeo rico em galactose extraído das algas vermelhas, utilizado para tornar os meios sólidos numa percentagem de 2%

  
• Tipos de meios de cultura


  • Meio natural
  • Meio seminatural
  • Meio sintético ou quimicamente definido
  • Meio complexo ou quimicamente não definido
• Fins a que se destinam os meios de cultura


  • Meios seletivos
  • Meios diferenciais ou determinativos
  • Meios mínimos
  • Meios completos
• Macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento são constituintes dos meios de cultura
• Meios seletivos


  Meios que contêm substâncias que inibem o crescimento de alguns microrganismos (ex: antifúngicos, corantes, sais biliares, elevada concentração de NaCl)
• Otimização do meio


  Ajustar o meio ao pH ótimo do microrganismo alvo para promover o crescimento
• Meios diferenciais ou determinativos


  Permitem distinguir diferentes microrganismos com base em características observáveis do padrão de crescimento nesse meio
• Meio diferencial para Staphylococcus aureus / Staphylococcus epidermidis


  • Meio seletivo - elevada concentração salina
  • Meio diferencial - manitol como fonte de carbono fermentativa + indicar o pH de Staphylococcus aureus - halo à volta das colónias devido à acidificação do meio resultante da formação de ácido lático
• Meios mínimos


  Meios basais que possuem os nutrientes exclusivamente necessários para o crescimento dos organismos, incluindo os fatores de crescimento
• Meios completos


  Meios mínimos que possuem suplementos extra (ex: adiciona-se um composto que permite o crescimento de uma bactéria mutante para esse composto)
• Classificação dos nutrientes adicionados aos meios


  • Macronutrientes - concentração superior a 0,1 mM (ex: carbono, oxigénio, hidrogénio, azoto)
  • Micronutrientes - concentração inferior a 0,1 mM (ex: zinco, cobre, níquel)
  • Fatores de crescimento - micronutrientes orgânicos (ex: vitaminas)

  
• A maior parte das células necessita de alguns iões metálicos (cálcio, potássio, magnésio, ferro, manganésio, zinco, cobre, molibdénio, níquel, cobalto e sódio) para as suas várias atividades celulares, sendo usados como cofatores e ativadores de enzimas
• Preparação de meios de cultura


  1. Retirar o excesso de terra da superfície das raízes

  2. Cortar a raiz em pequenas porções e adicionar a um frasco com solução de água destilada esterilizada, formando uma suspensão

  3. Agitar o frasco durante 30 minutos na estufa

  4. Realizar diluições sucessivas (1 para 10) com pipeta e vórtex

  5. Inocular as diluições em meio B de King

  
• Meio B de King


  Meio diferencial que permite diferenciar bactérias do género Pseudomonas, que produzem um pigmento fluorescente

  
• Isolamento e purificação de culturas


  1. Retirar 0,1 g de solo e adicionar a 5 ml de água destilada

  2. Realizar diluições sucessivas (1 para 10) e inocular em meio YEPGA (geral) e meios seletivos (YEPGA+CAP para fungos, YEPGA+CYC para bactérias)

  3. Pasteurizar a 80ºC para selecionar bactérias formadoras de endósporos (Bacillus)

  4. Realizar purificação por esgotamento do inóculo em placas de Petri
• Técnica de purificação por esgotamento do inóculo


  Diluir bactérias por estrias sistematicamente ao longo do exterior do ágar, de forma a obter colónias isoladas

  
• Nos fungos, o processo de purificação é diferente, retirando um pouco de micélio com uma ansa

  
• Coloração de Gram


  Método que permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular, com base nas colorações adquiridas após tratamento com agentes químicos