DNA-replikasjon

• DNA replikasjon


  Utføres av polymeraser
• DNA-polymeraser


  Katalyserer dannelse av fosfodiesterbindinger som binder enheter av DNA-ryggraden sammen
• Typer DNA-polymeraser


  • E. coli har fem som deltar i DNA-replikasjon og reparasjon
• Vi vil fokusere på to av de bedre forståtte polymerasene: DNA-polymerase I og DNA-polymerase III
• DNA-polymeraser


  Katalyserer trinnvis tillegg av deoksyribonukleotider til en DNA-streng
• DNA-syntese


  Krever nøye regulert presisjon og bruker deoksyribonukleosidtrifosfat (dNTP) som substrat
• Ny DNA-streng

  Blir satt sammen direkte på en forhåndseksisterende DNA-templat
• DNA-polymeraser


  • Krever en primer for å starte syntesen
  • Syntesen skjer i 5'-til-3'-retning
• Separasjonen av DNA-strenger


  1. Krever spesifikke helikaser

  2. Krever ATP-hydrolyse
• Mange DNA-polymeraser


  • Kan korrigere feil i DNA ved å fjerne umatchede nukleotider
• DNA-replikasjonens spesifisitet dikteres av basenes komplementaritet mellom nukleotider
• Helikaser


  En stor og mangfoldig familie av enzymer som deltar i mange biologiske prosesser
• DNA-polymeraser har en lav feilrate takket være induksjonstilpasning, hvor enzymstrukturen endres når riktig nukleotid bindes
• Helikaser i DNA-replikasjon


  • Vanligvis oligomerer som inneholder seks subenheter som danner en ringstruktur
• Virkningen av en helikase

  Involverer en ATP-syklus som driver separasjonen av DNA-strenger
• DNA-replikasjon er svært koordinert
• Topoisomeraser


  1. Forbereder den doble heliksen for avvikling

  2. Introduserer eller eliminerer supercoils ved midlertidig å kløve DNA
• Replikasjon


  Starter på et unikt sted innenfor E. coli-genomet, kalt oriC-locus
• OriC-locus


  • Inneholder flere kopier av en sekvens som er foretrukne bindingssteder for opprinnelsesgjenkjennelsesproteinet DnaA
• Polymeraser


  • Øker nøyaktigheten av replikasjonen ved å bruke proofreading-mekanismer
• DNA-replikasjon


  1. DnaA-proteiner oligomeriserer og binder seg til oriC-locus

  2. Andre proteiner som DnaB kommer til
• DNA-polymerase I fra E. coli

  • Har en eksonukleaseaktivitet i tillegg til polymeraseaktiviteten
  • Bidrar til å fjerne feil i den nydannede DNA-strengen
• DnaB


  En helikase som bruker ATP-hydrolyse for å avvikle DNA-duplexen
• DNA-replikasjon


  1. Den ledende og etterslepstråden syntetiseres samtidig på en koordinert måte

  2. DNA-polymerase III starter syntesen av den ledende tråden fra RNA-primeren dannet av primase

  3. Helikasen avvikler den doble DNA'en foran polymerasen

  4. Enkelttrådsbindingsproteiner binder seg til de avviklede trådene for å holde dem separert slik at begge trådene kan fungere som maler

  5. Den ledende tråden syntetiseres kontinuerlig av polymerase III

  6. Topoisomerase II introduserer samtidig negative supercoils for å forhindre en topologisk krise

  7. Synthesen av den etterslepstråden er koordinert med syntesen av den ledende tråden

  8. DNA-polymerase III-holoenzymet inkluderer to kopier av polymerasekjernen, som består av DNA-polymerasen selv, en 3'-til-5' korrekturlesende eksunuklease, to kopier av den dimeriske B2-underenheten glideklemme, og flere andre proteiner

  9. Den etterslepstrådens mal er buet slik at den passerer gjennom polymerasestedet i en underenhet av polymerase III i 3' → 5'-retning

  10. Etter å ha lagt til omtrent 1000 nukleotider, slipper DNA-polymerase III malen for den etterslepstråden ved å frigjøre den glidende klemmen

  11. Denne replikasjonsmodusen er kalt trombonemodellen fordi størrelsen på sløyfen forlenges og forkortes som lysbildet på en trombone

  12. Hullene mellom fragmentene av den nydannede etterslepstråden fylles av DNA-polymerase I

  13. DNA-ligase kobler til slutt fragmentene

  14. DNA-replikasjonen termineres på distinkte steder i E. coli ved hjelp av spesifikke termineringssider og proteinet Tus

  15. DNA-syntesen er mer kompleks i eukaryoter enn i bakterier på grunn av størrelsen, antallet kromosomer og lineær natur

  16. Reproduksjon i eukaryoter krever bruk av flere replikasjonsopphav, og kontrollmekanismer sikrer at hver replikon replikeres bare én gang per celledivisjon

  17. To distinkte polymeraser er nødvendig for å kopiere et eukaryotisk replikon, og overføringen av polymerase kalles polymeraseskifte
• Single-strand-binding proteiner (SSB)


  Binder seg til de nydannede enkelttrådsregionene og forhindrer at de to komplementære trådene gjenforenes
• DNA-replikasjon


  1. En RNA-primer syntetisert av primase muliggjør starten av DNA-syntese

  2. Begge strengene av foreldre-DNA fungerer som mal for syntesen av nytt DNA
• DNA-replikasjon


  • Krever svært prosessive polymeraser
  • DNA-polymerase III-holoenzymet har høy katalytisk potens og prosessivitet
• Telomerer


  Unike strukturer ved endene av lineære kromosomer
• B2-underenheten


  Fungerer som en glideklemme som holder DNA-skabelonen stabil under replikasjonen
• Genomene til nesten alle bakterier er sirkulære, mens kromosomene til mennesker og andre eukaryoter er lineære
• Klemmebelastere


  Fungerer som monteringssett for glideklemmen, som deretter fester seg til DNA-et
• Lineære DNA-molekyler


  Introduserer flere komplikasjoner
• Telomerer


  • Inneholder hundrevis av tandemrepetisjoner av en heksanukleotidsekvens
  • En av trådene er G-rik ved 3'-enden, og den er litt lengre enn den andre tråden
  • I mennesker er den gjentatte G-rike sekvensen AGGGTT
• Telomerer


  Beskytter effektivt kromosomenden mot nedbrytning
• Telomerer replikeres av


  1. Telomerase, et spesialisert polymerase som bærer sin egen RNA-mal

  2. Telomerase legger til nukleotider på den ledende tråden slik at den etterslepstråden alltid opprettholder omtrentlig lengde
• Aktiviteten til telomerase er lav eller fraværende i de fleste humane celler
• Telomerforkorting


  Tjener som en tellerenhet for å begrense celleproliferasjon
• Telomerforkorting


  Kan spille en rolle i aldring og utviklingen av patologiske tilstander
• Telomerase er en potensiell mål for kreftbehandling, da kreftceller uttrykker høye nivåer av telomerase mens de fleste normale celler ikke gjør det
• Feil i DNA-replikasjonen


  Muligheten for at en feil base kan bli inkorporert, og danne en ikke-Watson-Crick basepar