TP 6,7

• Riscos associados ao trabalho laboratorial em Imunologia

  • Níveis de segurança biológica
  • Métodos de Imunoensaio
• Métodos serológicos com base em interações primárias
• Métodos serológicos com base em reações 2árias (Ensaios indiretos)


  • Reações de precipitação
  • Reações de aglutinação
  • Reações de Fixação do complemento – Lise (ausência) de células alvo
• Métodos serológicos com base em reações 1árias ou Imunoensaios com substâncias marcadas (Ensaios diretos)


  Permitem a visualização e/ou quantificação da ligação direta do AG ao AC

  
• Algumas reações antigénio/anticorpo não são detetadas por precipitação ou aglutinação
• Ligando


  Substância que vai ser medida – molécula a que se liga outra molécula de uma configuração complementar, geralmente liga-se à substância que o teste está a tentar detetar
• Receptor


  Liga-se à molécula alvo específica
• Imunoensaios Homogéneos


  • São métodos rápidos em que a interação do AG com o AC modula a atividade do marcador
  • Nenhum elemento está fixo a uma fase sólida e não existe etapa de separação
  • Têm sido geralmente utilizados para a medição de pequenos analitos, tais como drogas de abuso e fármacos
• Imunoensaios Heterogéneos


  • Métodos em que um dos elementos do ensaio está fixo a uma fase sólida
  • A reação antigénio-anticorpo não interfere com a atividade do elemento marcado
  • É necessário uma etapa de separação das frações livres em relação às conjugadas
• Os métodos heterogéneos apresentam vantagens sobre os homogéneos
• Vantagens dos métodos heterogéneos

  • Sensibilidade
  • Especificidade
• Reações 1árias


  • São métodos que envolvem a ligação direta ao anticorpo
  • Baseiam-se no mesmo princípio, mas a forma de detetar a união específica é diferente
• Suporte para Reações 1árias

  • Plástico (ex: microplaca de poliestireno)
  • Papel de nitrocelulose ou nylon após transferência do gel de electroforese
  • Culturas celulares ou tecidos
• Ensaios Imunoenzimáticos (EIA)


  • Utilizados para detetar/quantificar Ac e Ag em fluidos biológicos, utilizando enzimas em vez de isótopos radioativos
  • Marcadores enzimáticos: fosfatase alcalina, peroxidase, glucose-6-fosfato desidrogenase, β-galactosidase, etc.
  • Sistemas de deteção: fotométricos, de fluorescência e de quimiluminescência
• Peroxidase (Horseradish peroxidase - HRP)


  • Catalisa oxidação de substâncias pelo peróxido de hidrogénio
  • Substratos da HRP: O-phenylenediamine dihydrochloride (OPD), 5-aminosalicylic acid (5AS), Tetramethylbenzidine (TMB), 2,2 azino-di(3-ethylbenzothiazoline) (ABTS), 4-Cloronaphthol, Diaminobenzidine (DAB)
• Fosfatase Alcalina (AP)


  • Catalisa hidrólise não específica de ésteres do ácido monofosfórico em fosfato inorgânico (reação em pH alcalino)
  • Substratos da AP: p-nitrofenilfosfato (p-NPP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /nitro blue tetrazolium (BCIP/NTP)
• Ensaios Imunoenzimáticos (EIA)


  • ELISA
  • ELISPOT
  • Immuno-blot
  • Western-blot
  • Imunoperoxidase
• ELISA


  Técnica bioquímica que permite quantificar o AC ou AG na ordem dos nanogramas (10-9 g)
• Tipos de ELISA


  • ELISA direto
  • ELISA indireto
  • Imobilização não específica
  • Imobilização específica
  • ELISA de captura ou em "sandwich"
  • ELISA competitivo versus não competitivo
• ELISA direto


  A enzima reveladora está ligada ao AC que se liga ao AG
• ELISA indireto


  A enzima reveladora está ligada ao AC secundário que se liga ao AC 1º
• ELISA de captura ou em sandwich


  O AG é imobilizado por captura de um AC específico adsorvido na superfície da placa
• ELISA competitivo


  O AG marcado com enzima compete com o AG contido na amostra do doente para a ligação ao AC imobilizado na placa
• ELISA


  Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
• Desvantagens da ELISA: Reactividade cruzada pode ocorrer com o anticorpo secondário, resultando num sinal não específico. É necessário um passo extra de incubação.
• Como amplificar o sinal da ELISA

  Uso de biotina-avidina
• Método de captura ou em sandwish da ELISA

  O AG é imobilizado por captura de um AC específico adsorvido na superfície da placa
• Método competitivo da ELISA

  1. AC adsorvido à fase sólida

  2. Adição do AG marcado com enzima + amostra do doente

  3. O AG marcado com enzima compete com o AG contido na amostra do doente para a ligação ao AC imobilizado na placa

  4. Se a amostra do doente tiver o AG específico inibirá a ligação do AG marcado ao AC imobilizado. A cor do substrato modificar-se-á muito pouco ou nada

  5. Se a amostra do doente não tiver o AG, o AG marcado com a enzima ligar-se-á aos ACs imobilizados na placa e, ao adicionar-se o substrato,verificar-se-á uma significativa alteração de cor
• Método não competitivo da ELISA

  1. Ag adsorvido à fase sólida

  2. Adição da amostra do doente contendo ACs

  3. Incubação

  4. Adição do 2º AC- AC marcado com enzima - vai-se ligar ao AC do paciente

  5. Se a amostra do doente tiver o AC específico este ligar-se-á ao AC marcado. A cor do substrato vai mudar significativamente

  6. Se a amostra do doente não tiver o AC, o AC marcado com a enzima não se vai ligar e, ao adicionar-se o substrato não se irá verificar uma significativa alteração de cor
• Método competitivo da ELISA

  Quanto maior a concentração da molécula a avaliar, menor a densidade óptica obtida
• Método não competitivo da ELISA

  Quanto maior a concentração da molécula a avaliar, maior a densidade óptica obtida
• Técnica de captura antigénica da ELISA

  1. AC imobilizado numa placa de microtitulação

  2. Adição de um AG e ocorre a ligação ao AC

  3. Adição de um 2º AC ligado a uma enzima, liga-se ao AG

  4. Adição de substrato

  5. Alteração de cor
• Técnica de captura de anticorpos da ELISA

  1. Fixação de um AC de captura ao suporte sólido

  2. Adição da amostra, contendo o AC em investigação

  3. Lavagem

  4. Adição do AG específico para o AC

  5. Adição do anticorpo conjugado a uma enzima

  6. Lavagem do excesso de AG e de anti-AG conjugado

  7. Adição do substrato cromogénico
• Aplicações práticas da ELISA

  • Deteção de infeções
  • Medição do nível de hormonas
  • Evidenciar contaminação viral
  • Deteção de substâncias alergenicas
  • Diagnóstico de coágulos sanguíneos, alergias, entre outras
  • Deteção de drogas ilícitas
  • Quantificação de toxinas em comida contaminada
  • Medição de fatores reumatóides e outros auto-anticorpos em doenças autoimunes
• Determinação da concentração de antigénio ou anticorpo por ELISA


  Através de uma curva standard, construída utilizando padrões de antigénio (ou anticorpo) de concentração conhecida, é possível determinar a concentração de antigénio (ou anticorpo) nas amostras desconhecidas
• Cada grupo terá 1 linha na placa de Elisa
• FN e AF são iniciais de nomes (se as amostras tiverem números, as letras serão substituídas pelos números das amostras)
• RIA (RadioImmunoAssay)


  Método sensível para a análise quantitativa das reações AC-AG, permitindo medidas rápidas e precisas, mesmo em preparações não purificadas
• Sistemas básicos de RIA

  • RIA indireto
  • RIA por competição
  • RIA de captura
• RIA indireto


  1. Adicionar uma quantidade conhecida de AC que se irá fixar ao suporte sólido

  2. Acrescenta-se um AG marcado, misturado com uma amostra teste ou com soluções padrão com concentrações conhecidas de AG não marcado

  3. Incubação

  4. Separa-se o AG não ligado do complexo marcado e mede-se a radioatividade da fase sólida