Méthodes d'étude

• Le microscope est un outil utilisé en histologie pour observer des échantillons très fins.
• La résolution est la distance minime entre 2 points à laquelle les points sont perçus comme distincts.
• Le MET permet d’observer la structure subcellulaire des cellules (intérieur)
• Les étapes de préparation du MET comprennent la fixation au formaldéhyde, la déshydratation, le solvant étant toluène ou xylène, l'enrobage en paraffine avec durcissement à froid, le coupage au microtome, et le marquage par coloration à l'HE.
• Une petite distance est une bonne résolution, c'est-à-dire, une meilleure séparation des éléments.
• Le microscope optique fonctionne en observant un échantillon traversé par des photons (lumière) qui arrivent jusqu’à l’œil.
• La formation de l’image est due aux couleurs des photons qui arrivent à nos yeux après passage par l’échantillon.
• Certains phénomènes optiques empêchent une partie des photons d’arriver jusqu’aux yeux, comme la réfraction et la diffraction.
• La couleur observée correspond à ceux qui sont passés.
• Dans les zones blanches, tous les photons passent, c'est-à-dire, il n'y a pas de matière ou la matière est incolore.
• La correction pour l’histoenzymologie consiste à analyser une image avec étapes : l’image est-elle colorée, quelle est la coloration, quel est le microscope utilisé, quelle est l’échelle de l’observation, quel est le microscope le plus résolutif, quelles sont les étapes de préparation et les substances utilisées.
• L’anticorps primaire est reconnu par la méthode d’histoenzymologie, une technique permettant de montrer l’activité enzymatique dans une cellule.
• La préparation pour l’histoenzymologie nécessite pas de fixation ou fixateurs spécifiques, est préservée par congélation et permet d’identifier des sous-types cellulaires avec la même morphologie mais des activités différentes.
• Le microscope électronique s'appuie sur la projection d'électrons ensuite captés par un détecteur.
• Le support utilisé en histologie est le papier ou les lames.
• Les solvants utilisés en histologie sont le toluène, le xylène, l’éthanol et l’eau.
• Le microtome permet de couper des échantillons de 2 à 10 μm.
• Applications : Détecter des segments de génome (indices de maladies génétiques), Détecter un type cellulaire, Identifier un type cellulaire.
• L’ultra microtome permet de couper des échantillons de 60 à 150 nm.
• Applications : Détecter des segments de génome (indices de maladies génétiques), Détecter un type cellulaire, Identifier un type cellulaire, Localiser des protéines dans un complexe protéique.
• Marquée avec un fluorochrome : technique FISH (Fluorescence In - Situ Hybridisation) → observation immédiate.
• L’enrobage en histologie est réalisé avec la paraffine.
• Colorations spéciales II - Hybridation in - situ : Reconnaissance d’un fragment d’ADN ou d’ARN par une sonde (ARN ou ADN) complémentaire marquée.
• Marquage en histologie est le processus de créer du contraste avec des substances différentes selon le microscope.
• Le marquage en histologie peut être effectué par des techniques comme la coloration, l’immunomarquage, l’hybridation in situ, l’histoenzymologie, la cryofracture, la métallisation et la microtomie ultramicroscopique.
• Immunomarquage : Reconnaissance d’un segment de protéine (antigène) par un anticorps, lui-même reconnu par un anticorps secondaire marqué.
• La déshydratation en histologie est réalisée avec l’aide d’éthanol de concentration.
• Les méthodes de fixation utilisées en histologie sont le formol, le glutaraldéhyde, le tetraoxyde d’osmium et l’eau.
• Le microscope électronique à transmission (MET) fonctionne en observant les électrons qui traversent l’échantillon pour arriver au capteur.
• Le microscope électronique à balayage (MEB) fonctionne en observant les électrons qui heurtent l’échantillon, arrachent des électrons de l’échantillon (e-secondaires) et les e-secondaires sont captés par le détecteur.
• Les mêmes étapes sont utilisées pour la préparation des échantillons pour les deux types de microscopes.
• La fixation est la première étape de la préparation des échantillons.
• La déshydratation est une étape de la préparation des échantillons qui enlève l'eau.
• L'enrobage est une étape de la préparation des échantillons qui durcit l'échantillon.
• La coupe est une étape de la préparation des échantillons qui réduit la taille de l'échantillon.
• Microscopie optique:

  Echantillon traversé par photons (lumière) arrivant jusqu'à l'oeil

  Grossissement grâce à 2 lentilles Résolution = 0.2 µm

  Couleur observée de l'image correspond aux photons qui sont passés
• Microscopie optique

  A) oculaire

  B) objectif

  C) échantillon

  D) condenseur

  E) diaphragme

  
• Microscopes électroniques Projection d’électons ensuite captés par un détecteur Traitement informatique Résolution = 0.2 nm
• MET

  A) source d'électrons

  B) Coupe contrastée

  C) objectif

  D) projection

  E) détecteur

  
• MET

  • Les électrons TRAVERSENT l’échantillon pour arriver au capteur
  • Observation : INTERIEUR des cellules (structures subcellulaires)