Annexe méthodologie

• Microscopes

  Agrandir l’image de l’échantillon et créer des contrastes faisant ressortir les détails de l’image agrandie
• Microscopes

  Augmentent le pouvoir de résolution de l’œil pour observer les structures cellulaires et détecter des molécules dans les cellules
• Microscopes photoniques (MP)

  Utilisation du microscope à fond clair pour observer les cellules en utilisant une coloration ou des microscopes à contraste de phase et d’interférence différentielle sans coloration
• Microscope à fond clair

  Utilisation de la lumière naturelle (photons) qui traverse l'objet examiné, nécessité d'une coloration pour produire un contraste suffisant
• Microscope à fluorescence (MF)

  Utilisation de filtres et miroirs dichroïques pour illuminer des échantillons fluorescents à leur longueur d’onde d’excitation, permet la localisation de molécules dans la cellule
• Microscope à fluorescence (MF)

  • Cellules vivantes en culture observées au microscope à fond clair sans filtre et avec filtre à contraste de phase, cellules observées au microscope à contraste de phase et à contraste d’interférence différentiel
• Types de microscopes

  • Microscope à fond clair
  • Microscope à contraste de phase
  • Microscope à contraste d’interférence différentiel
  • Microscope confocal
  • Microscope électronique à transmission (MET)
  • Microscope électronique à balayage (MEB)
• Le microscope confocal rend possible l’observation d’objets épais (< 500µm) et fluorescents, ce qui n’est pas possible avec les microscopes présentés précédemment. Un mince faisceau laser est focalisé sur un plan défini de l’échantillon dont on obtient une image bidimensionnelle. Le balayage de plusieurs plans successifs (appelés sections optiques) permet une reconstitution tridimensionnelle de l’objet après traitement numérique.
• Les microscopes électroniques sont construits sur le même principe que le microscope photonique mais utilisent à la place des photons, des électrons émis dans une colonne sous vide poussé. Leur pouvoir de résolution est environ 103 x supérieur à celui du microscope photonique (0,2 nm au lieu de 0,2 µm).
• Microscope électronique à transmission (MET)

  Le faisceau d’électrons traverse l’échantillon, dont l’épaisseur est inférieure à 0,1 µm, puis est focalisé sur un écran pour former une image. Les électrons qui heurtent des atomes lourds préalablement fixés sur l’échantillon sont réfractés. Les autres traversent et impressionnent un écran où se forme l’image finale des structures cellulaires. Les échantillons biologiques sont constitués d’atomes légers (C, H, O, N, …) et doivent par conséquent être contrastés avec des sels de métaux lourds (acétate de plomb ou d’uranyle, …). Il existe 2 types de contrastes : positif (sels de métaux accumulés sur les structures cellulaires) ou négatif (sels déposés sur le film). Les cellules et les tissus peuvent aussi être traités par cryofracture pour être observés au MET.
• Microscope électronique à balayage (MEB)

  Le faisceau d’électrons ne traverse pas l’échantillon mais balaie sa surface préalablement recouverte de métal. Les électrons diffractés sont capturés pour donner une image tridimensionnelle de la surface cellulaire.
• Technique de cryofracture


  1. Congélation rapide de l'échantillon

  2. Fracture de l'échantillon à très basse température et sous vide élevé

  3. Fabrication d'une réplique des surfaces de fr
• Cell types

  • gauche
  • cellule dendritique
  • lymphocyte
• Technique de cryofracture

  1. Congélation rapide de l'échantillon

  2. Fracture de l'échantillon à très basse température et sous vide élevé

  3. Fabrication d'une réplique des surfaces de fracture par vaporisation verticale (angle de 45°C) d’un métal lourd (platine) et de carbone

  4. Digestion de la matière organique, lavage et observation de la réplique au microscope électronique à transmission
• L'observation au microscopie électronique à transmission des répliques obtenues après cryofracture permet de visualiser l'intérieur hydrophobe de la membrane plasmique (face P ou protoplasmique, située côté cellule ; face E ou exoplasmique, située côté externe)
• Préparation des échantillons

  1. L’observation de cellules nécessite, dans la plupart des cas, une préparation des échantillons à observer

  2. Pour l’étude en microscopie classique, qu’elle soit photonique ou électronique, les tissus sont généralement fixés chimiquement (par un traitement qui rigidifie le tissu), coupés, puis colorés (pour la MO) ou contrastés (pour le ME)

  3. L’étude de cellules isolées au MP (cellules sanguines, bactéries) ne nécessite pas de coupes mais peut être réalisée sur un frottis

  4. Pour visualiser l’intérieur des membranes cellulaires, on aura recours à la technique de cryofracture

  5. Des macromolécules ou particules isolées peuvent être visualisées après ombrage métallique (vaporisation avec un angle de 45°C) ou coloration négative (évaporation)

  6. On peut enfin observer des échantillons massifs (microscopie confocale, MEB)
• Repérage de molécules dans la cellule

  1. par des réactions cytochimiques spécifiques (acide périodique de Schiff (PAS), spécifique des sucres)

  2. par un colorant fluorescent ou une protéine naturellement fluorescente associée (GFP)

  3. par autoradiographie lorsque la molécule recherchée a incorporé un atome radioactif dans ses structures

  4. par cytoenzymologie : il s’agit de détecter une enzyme (phosphatase ou peroxydase) par le produit de son activité repérable en MP ou ME

  5. par immunocytochimie pour localiser une protéine ayant des propriétés antigéniques ; on utilise le principe de reconnaissance spécifique d’un antigène par un anticorps marqué. Si l’anticorps est couplé à une enzyme générant un précipité coloré, on parle de révélation chromogénique, si l’anticorps est couplé à un fluorochrome, on parle d’immunofluorescence

  6. par sondes nucléotidiques dans le cas de l’hy
• Principe de reconnaissance spécifique d’un antigène par un anticorps marqué

  1. Utilisation d'un anticorps couplé à une enzyme générant un précipité coloré = révélation chromogénique

  2. Utilisation d'un anticorps couplé à un fluorochrome = immunofluorescence
• Hybridation in situ

  Détection par sondes nucléotidiques
• Techniques d'immunocytochimie et immunofluorescence permettent la détection de protéines antigéniques dans la cellule à l'aide d'anticorps marqués
• Structure d'un anticorps IgG

  Composé de 4 chaînes polypeptidiques (2 lourdes, 2 légères), 2 sites de liaison à l'antigène, et de nombreux sites caractéristiques de l'espèce qui produit l'anticorps
• La grande spécificité de reconnaissance des molécules Ac-Ag permet de mettre en évidence une molécule particulière parmi des milliers d'autres dans la cellule
• Les complexes Ac-Ag ne sont pas visibles directement au microscope, on les rend décelables en accrochant un marqueur à l'anticorps
• Marqueurs utilisés pour rendre les complexes Ac-Ag décelables

  • Fluorochrome, enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline), isotope radioactif, or colloïdal ou ferritine
• La méthode de détection peut être directe ou indirecte
• Méthode directe de détection

  Le marqueur est fixé directement sur l'anticorps utilisé pour détecter l'antigène
• Méthode indirecte de détection

  L'anticorps primaire qui se lie à l'antigène n'est pas marqué, mais est détecté par un autre anticorps (anticorps secondaire) auquel on a lié un marqueur
• L'anticorps secondaire est un anticorps anti-espèce dirigé contre tous les anticorps de l'espèce ayant servi à fournir l'anticorps primaire
• L'intérêt de la méthode indirecte est d'amplifier le marquage en reconnaissant une seule molécule d'anticorps primaire par de nombreuses molécules d'anticorps secondaire marquées
• espèce ayant servi à fournir l'Ac primaire
• Préparation des anticorps pour l’immunocytochimie et l’immunoflurescence

  1. Injection de l’antigène à un lapin

  2. Injection à un mouton d’immunoglobulines de lapin

  3. Réaction immunitaire: production d’anticorps

  4. Immunoglobulines (IgG) de lapin dans le plasma sanguin = ANTICORPS « PRIMAIRE »

  5. anti IgG de lapin = ANTICORPS « SECONDAIRE » (polyclonal)
• Immunocytochimie par la méthode indirecte
• Antigène: protéine isolée & purifiée, que l’on veut mettre en évidence dans les cellules/tissus
• Marquage radioactif

  1. Les cellules construisent leurs propres constituants à partir de molécules simples, appelées précurseurs

  2. Le marquage radioactif consiste à fournir à des cellules vivantes un précurseur radioactif dans lequel un atome est remplacé par son isotope radioactif

  3. Les cellules incorporent ces précurseurs radioactifs dans les molécules en cours de synthèse qui deviennent ainsi radioactivement marquées

  4. Le précurseur radioactif doit marquer le plus spécifiquement possible un type de molécule donné
• Technique « pulse-chasse »

  1. Un précurseur radioactif de la substance dont on veut définir le lieu de synthèse est fourni pendant un temps bref (pulse)

  2. On réalise une chasse en fournissant immédiatement après le pulse une grande quantité du même précurseur, non radioactif, afin d’étudier son devenir dans la cellule

  3. Les éléments synthétisés au cours de la chasse utilisent les précurseurs non radioactifs et ne sont pas marqués

  4. On peut ainsi suivre les déplacements dans la cellule de la seule substance marquée, synthétisée pendant le pulse
• Détection des macromolécules marquées par autoradiographie

  1. Les isotopes radioactifs incorporés dans les macromolécules émettent des rayons gamma qui impressionnent une émulsion photographique dont on a recouvert les coupes de cellules

  2. On peut observer au microscope photonique ou électronique des « grains d’argent » en superposition avec l’image de la cel
• Ion des macromolécules marquées par autoradiographie

  Les isotopes radioactifs incorporés dans les macromolécules émettent des rayons gamma qui impressionnent une émulsion photographique dont on a recouvert les coupes de cellules. On peut observer au microscope photonique ou électronique des « grains d’argent » en superposition avec l’image de la cellule, à l’emplacement des molécules radioactives.
• Photographie d’une immunofluorescence réalisée sur une cellule Hela, traitée par un anticorps anti-tubuline (filaments verts), et par le colorant nucléaire DAPI (bleu)
• Photographie réalisée au MET, sur une coupe d’épithélium intestinal, après immunomarquage par un anticorps anti-transporteur Aquaporine, révélé par un anticorps secondaire couplé à des billes d’or. L’image de droite est un agrandissement de celle de gauche (carré). (Biol. Cell 2006, 97 :823).
• Le WB (Western Blot) ou Immunoblot permet de détecter une (des) protéine(s) spécifique(s) dans un lysat cellulaire. Il ne permet pas de localiser une protéine dans une cellule, mais apporte des informations sur sa présence/absence, son poids moléculaire apparent, sa quantité relative dans l’échantillon.