Baka: Pharmacodynamie expérimentale

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  • Il existe deux types d’études
    -Étude des liaisons spécifiques haute affinité (Binding)
    -Études fonctionnelles 
  • Etude de binding: Objectif principal = détermination de l’affinité
  • Études fonctionnelles : 
    Objectif principal = Étude des « conséquences » de la liaison ligand récepteur + établissement des courbes (dose – effet)
  • Les outils de la pharmacodynamie expérimentale
    A) liaisons
    B) spécifiques
    C) fonctionnelles
  • Les liaisons spécifiques : ce sont les liaisons aux récepteur. Elles sont saturables et avec une grande affinité
  • Binding: Deux méthodes: De saturation
    De compétition
  • La méthode de saturation 
    -Cette méthode s’applique sur des préparations membranaires. Le ligand étudié se fixe à ces récepteurs (liaisons saturables) et s’adsorbe sur les membranes cellulaires (liaisons non saturables)
  • Méthode de saturation: Seules les liaisons saturables nous intéressent pour déterminer l’affinité. Il faut donc les « individualiser ». 
  • Méthode de saturation: Les membranes cellulaires interfèrent car seules les liaisons saturables nous intéressent, donc on essaye d’imaginer un protocole pour les enlever afin de déterminer l’affinité.
  • Méthode de saturation: On considère 2 séries de preparations mémbrannaires traitées indépendament. 
  • Méthode de saturation:  on introduit du ligand marqué (radioactive notée L*). On fait un lavage pour éliminer L* non fixé et on mesure la radioactivité et on quantifie ce qui a été lié aux recepteurs ; Donc affinité totale (spé et non spé). 
  • Méthode de saturation :
    Série 2 : Maintenant on introduit un ligand non marqué qui va saturer les recepteurs, puis on introduit des quantités croissante du ligand marqué et on fait un lavage pour éliminer ligand marqué non fixé, mesure de la radioactivité. Dans cette deuxième série, le ligand froid va tout saturé, donc quand on mesure la radiactivité on mesure que les liaisons insaturables. 
  • Méthode de saturation
    On exprime la radioactivité détectée en fonction de la concentration du ligand L* utilisée
  • Méthode de saturation:
    KD: La concentration de L marqué correspondant à une valeur de 50% du plateau
  • On peut avoir recours à des manipulations mathématiques permettant la linéarisation des résultats :
    Représentation de Scatchard et Représentation de Hill
  • Avantages de la méthode de saturation: permet de déterminer l’affinité du ligand sans passer par l’étude de l’effet et est applicable aussi bien pour des agonistes que pour des antagonistes car, justement, elle ne requière pas l’étude de l’effet. 
  • Limites de la méthode de saturation: nécessite un échantillon radiomarqué de chaque ligand étudié. Ceci génère des contraintes techniques et économiques. 
  • Méthode de compétition: L’affinité est déduite de la capacité du ligand étudié à déplacer un ligand de référence radiomarqué de constante KD connue. 
  • Ci50 : Concentration du ligand X (non marqué) qui permet de "chasser"/ inhibe 50% de L* (la liaison spécifique du radio ligand).
     
  • Méthode par compétition:  on s’intéresse à X, si X a une grande affinité pour le récepteur, il va déplacer facilement L* du récepteur, donc une petite C° est suffisante pour chasser L* et Ci 50 sera donc petit.
  • CI50 = Concentration du ligand X (non marqué) qui inhibe 50% de la liaison spécifique du radio -ligand    
  • Métode par compétition :
    Plus la CI50 du ligand X est faible, plus sa capacité à déplacer le ligand de référence est importante, plus son affinité vis-à-vis du récepteur est importante. 
  • Plus la CI50 est faible, plus l’affinité du ligand X est importante car moins on aura besoin concentration de ce ligand X pour inhiber 50% de la liaison du ligand marqué
  • Le KD (déterminé par la méthode de saturation) est une caractéristique propre du couple (ligand – récepteur). Sa valeur ne dépend que de ces deux acteurs 
  • Quand on utilise la méthode par compétition, on détermine la Ci50 dont la valeur dépend du ligand X mais aussi de la nature et de la concentration du ligand de référence utilisé pour l’expérience. 
  • KD: C’est la constante de dissociation à l’équilibre . Elle est caractéristique de la liaison (ligand – récepteur) et ne dépend que de la nature de ces deux acteurs.
  • Méthode par compétition
    L’équation de Cheng et Prusoff: KI = CI50 / (1 + ([L*] / KD))
  • Ki: Constante de dissociation utilisant Ci50. Ici on note Ki (= KdX ) pour ne pas confonde avec celle de Kd du ligand de référence. (Kd L*)
     
  • Dans un exercice, si on a Ki alors on sait que c’est la méthode de compétition et Kd c’est que c’est méthode de saturation. En fonction des données dans l’exercice, on sait quelle méthode utiliser.  
     
  • Avantage méthode de compétition : C’est le ligand de référence (qui sera noté L*) qui est marqué radioactif MAIS pour tous les autres ligands inconnus, ils n’ont pas besoin d’avoir une version radiomarquée donc c'est plus pratique.
     
  • Avantage de la méthode de compétition  
    La méthode de compétition permet d’évaluer l’affinité de plusieurs ligands différents du même récepteur en utilisant un seul ligand de référence. 
  • Les approches fonctionnelles :
    On étudie les conséquences du ligand par rapport à son récepteur. Si agoniste, on étudie effet de cet agoniste, sinon on regarde capaciter à modifier l’effet de l’autre
     
  • On peut créer une courbe dose/réponse. On va faire une transformation en sigmoïde en utilisant le -log de CE50. Ainsi, la C° augmente elle aussi car -Log -> Proportionnel.
  • CE 50: c'est la C° d’agoniste qui fait 50% de l’effet maximal = pD2
  • Plus l’affinité ligand importante, plus CE 50 est faible car on a besoin d’une C° très faible de ligand