Lab tools

• Isocratisch = de hele tijd dezelfde omstandigheden (bijvoorbeeld zoutconcentratie) in de loopvloeistof. Dit in tegenstelling tot een gradiënt waarbij de omstandigheden geleidelijk veranderen, bijv. verhoging zoutconcentratie.

  Kan ook een pH gradiënt zijn, dan wordt de pH geleidelijk verlaagd of verhoogd.
• Eluens = de stof waarmee je elueert (kan de loopvloeistof zijn, bijvoorbeeld als je elueert met een zoutgradiënt)
• Eluent = de stof die je elueert
• Eluaat = de vloeistof die van de kolom komt. Hier kan je stof van interesse in zitten maar dit zal niet in alle fracties het geval zijn.
• •Een antilichaam is een eiwit dat specifiek aan een andere stof (bijv. eiwit) kan binden. De andere stof noemen we antigen.
• adsorptie chromatografie: verschil in polariteit tussen verschillende stoffen. •Polaire moleculen hebben meer affiniteit met de kolom door interacties met ladingen op kolom.••Apolaire moleculen gaan snel door de kolom.
• partitie chromatografie: scheiding op basis van oplosbaarheid van stoffen in verschillende buffers en hangt samen met de polariteit van de stoffen.
• reversed phase chromatografie:

  stationaire fase is a-polair, bijv silicagel waarbij si-oh groepen chemiscche gemodificeerd zijn, bijv alkyl met c-8 of c-18 ketens

  mobiele fase is relatief polair, bijv water
• normal phase chromatografie:

  stationaire fase: polair, bijv silicagel(polaire si-oh)

  mobiele fase: relatief a-polair, bijv hexaan/ethanoll
• Elektroforese = bewegen van geladen deeltjes onder invloed van een elektrisch veld. Scheiden van deeltjes (bijv. DNA of eiwit) op basis van lading
• Sterkte van elektrisch veld is afhankelijk van de spanning en de veldafstand
• Een deeltje met lading q ondervindt een kracht van q vermenigvuldigd met de veldsterkte. Dus als de lading van het deeltje groter is, dan wordt de elektrische kracht op het deeltje groter. Of als de spanning hoger is.
• Mobiliteit (µ) van een deeltje in een elektrisch veld hangt af van:

  ••Sterkte van het elektrisch veld (E)

  •Lading van het deeltje (q)

  •Weerstand in het medium (r)

  •Vorm molecuul
• Als viscositeit en snelheid toenemen, neemt ook de Fw toe.
• Warmte ontwikkeling leidt tot een verlaagde viscositeit η (medium vloeibaarder)
• Hoge spanning  

  snelheid omhoog (zowel door temp en elektrische kracht)

  slecht voor eiwitten (bij natieve condities)
• •Inert materiaal - Drager

  •Voorbeeld: cellulose acetaat (stof die lijkt op papier)

  •Drager materiaal heeft geen invloed op de scheiding

  •Scheiding op basis van lading alleen
• Poreus materiaal - Moleculaire zeef

  •Voorbeeld: Agarose en polyacrylamide

  •Drager materiaal vormt in gepolymeriseerde toestand een structuur met poriën (denk aan zeef of spons)

  •Heeft invloed op scheiding: scheidt op grootte!

  •Meest gebruikt: agarose voor DNA en polyacrylamide voor eiwitten
• DNA elektroforese: scheiding van DNA stukken met verschillende grootte
• Kleine fragmenten migreren alleen sneller als het DNA lineair is
• •Iso-electric-focusing (IEF) is een analytische natieve methode om eiwitten te scheiden op basis van hun pI.

  •Principe: je maakt een pH gradiënt (in een oplossing of gel). Daar laat je de eiwitten doorheen lopen onder invloed van elektrische stroom.

  •Elk eiwit migreert dan naar zijn eigen iso-elektrisch punt (IEP = pI).
• SDS = sodium dodecyl sulfate

  •Zeepachtige stof met negatieve lading.

  •Bindt over gehele lengte aan eiwitten.

  •Fragmenten krijgen uniforme negatieve lading  (netto eigen lading van fragmenten kan worden verwaarloosd)
• DTT = dithiothreitol

  •Reduceert disulfide-bruggen

  •Effect SDS en DTT: volledige denaturatie eiwit

  Ook veel gebruikt: β-mercaptoethanol
• Een combinatie van SDS en DTT wordt toegepast om ervoor te zorgen dat het eiwit compleet lineair is en overal evenveel negatieve lading heeft.
• Stacking gel: Andere pH en veel lager percentage acrylamide
• •Running gel (= resolving gel = separating gel): scheiding op grootte
• niet-gereduceerd SDS-page: geen DTT toegevoegd à Zwavelbruggen blijven intact à dit antilichaam migreert als 1 band van ~150 kDa.
• gereduceerd SDS-page: wel DTT toegevoegd: eiwit valt uit elkaar in subunits, zwavelbruggen verbroken.
• 2d elektroforese: eerst IEF en dan SDS-page. De strip van de IEF wordt bovenop een SDS-PAGE gel gelegd.

  Eiwitten met hetzelfde IEP maar met verschillende grootte (dat kan) worden zo van elkaar gescheiden;

  •Een techniek om het proteoom of een deel ervan te analyseren

  •(proteoom = totale eiwitinhoud van cellen op een bepaald moment)
• Een kationen wisselaar wordt dus gebruikt om positief geladen eiwitten (of andere stoffen) te scheiden
• een anionenwisselaar voor negatief geladen eiwitten.
• pH < pI: eiwit is positief geladen: kationenwisselaar

  pH > pI: eiwit is negatief geladen: anionenwisselaar
• •Bolle lens: stralen die evenwijdig aan de hoofdas in de lens vallen gaan na breking door het brandpunt
• De lenssterkte (in diopter) wordt groter als f kleiner wordt
• Een lens met een kortere brandpuntsafstand is sterker: de stralen worden meer afgebogen
• Nabijheidspunt is de kortste afstand waarop je nog scherp kunt zien
• Als de voorwerpsafstand afneemt, en de beeldafstand hetzelfde blijft, moet de brandpuntsafstand afnemen dus wordt de hoek groter.

  Het beeld op het netvlies wordt groter, je kunt meer details onderscheiden.
• D = scheidend vermogen = de kleinste afstand tussen twee punten waarop je ze nog als twee losse punten kunt zien.

  NA groot - d klein!

  Hoe kleiner de golflengte, hoe kleiner d en hoe beter het scheidend vermogen.
• sferische aberratie: aan de randen van de lens wordt het licht minder netjes afgebogen.

  Oplossing: diafragma een beetje dicht doen (heeft wel gevolgen voor hoeveelheid licht die wordt opgevangen)
• chromatische aberratie. Verschillende golflengtes worden nét even anders afgebogen.

  Achromatisch doublet (= een combinatie van een dubbelbolle en een platholle lens) corrigeert dit.