p2

• METODE PEMISAHAN DASAR

  1. Ekstraksi -> ekstrak
  2. Fraksinasi -> fraksi
• METODE PEMISAHAN DASAR : EKSTRAKSI

  Proses isolasi senyawa yang terdapat dalam campuran larutan atau campuran padat menggunakan pelarut yang sesuai
• METODE PEMISAHAN DASAR : FRAKSINASI

  Ekstraksi cair-cair

  Prinsip: pemisahan senyawa berdasarkan polaritasnya menggunakan pelarut yang tidak saling bercampur
• TUJUAN EKSTRAKSI

  1. Telaah fitokimia (memperoleh senyawa)
  2. Standardisasi Ekstrak
  3. Isolasi Senyawa Penanda (Marker)
  4. Uji Efek Farmakologi
  5. Bahan baku (Pembuatan sediaan)

  Keberhasilan penentuan senyawa aktif biologi dari tanaman sebagian besar tergantung pada jenis pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi
• KRITERIA PEMILIHAN PELARUT EKSTRAKSI

  1. Selektif (idealnya) mendukung tujuan untuk apa ekstraksi dilakukan.
  2. Universal
  3. Volatile
  4. Dapat diregenerasi
  5. Tidak toksik
  6. Tidak korosif
  7. Viskositas cukup rendah
  8. Tidak mahal
• METODE EKSTRAKSI

  1. CARA PANAS
  2. CARA DINGIN
• METODE EKSTRAKSI : CARA PANAS

  • Ekstraksi dengan melibatkan panas untuk senyawa-senyawa tahan panas.
  • Co : Reflux, soxhlet
• FRAKSINASI

  • METODE : ECC, KROMATOGRAFI (KROM. CAIR VAKUM; KROM. KOLOM KLASIK)
  • FASE DIAM BERVARIASI : FASE DIAM SILIKA GEL 60 (KROM. KOLOM) DAN SILIKA GEL H60 (KCV)
  • FASE GERAK BERVARIASI (SISTEM GRADIEN PELARUT ATAUPUN ISOKRATIK) : ELUSI BERGRADIEN DAPAT JUGA ISOKRATIK MENGGUNAKAN PELARUT ORGANIK.
• METODE PEMISAHAN LANJUTAN (DAN PEMURNIAN)

  • Menggunakan tekhnik Kromatografi atau gabungan tekhnik kromatografi (Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis, Kromatografi Gas Cair, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
  • Pemilihan tekhnik tergantung :

  1. Sifat kelarutan / polaritas senyawa
  2. Keatsirian senyawa

  • Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan, kromatografi dapat dibedakan menjadi: kromatografi adsorpsi; kromatografi partisi; kromatografi penukar ion; kromatografi eksklusi ukuran, kromatografi afinitas.
• KROMATOGRAFI PLANAR

  Berdasarkan fase DIAM yang digunakan, dapat

  dibedakan menjadi :

  1. KLT
  2. KKT
• KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

  • Identifikasi senyawa dapat dilakukan dengan menghitung nilai Rf, (Rf pembanding dengan Rf sampel).
  • Rf dihitung dengan cara membagi jarak yang ditempuh oleh senyawa yang dipisahkan dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak
• KLT : HARGA Rf DIPENGARUHI OLEH

  1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
  2. Sifat penyerap dan derajat aktivitasnya
  3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
  4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak
  5. Derajat kejenuhan dalam uap
  6. Teknik percobaan
  7. Jumlah cuplikan yang digunakan
  8. Suhu
  9. Kesetimbangan
• KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

  • Kelebihan : keserbagunaan, kecepatan, kepekaan
  • Kecepatan KLT : karena sifat penjerap (fase diam) yang padat
  • Kepekaan KLT : dapat memisahkan senyawa dalam jumlah microgram
• KLT : FASE DIAM

  • Silika Gel
  • Selulosa
  • Alumina,
  • Kieselgur
  • Poliamide
  • Sephadex.
  • Dapat mengandung indikator
  • flourosensi
• KLT : FASE GERAK

  Pelarut organik (non-polar sampai polar)
• KLT : DETEKSI SENYAWA

  Penampak bercak (lampu UV 254 nm dan 366 nm; pereaksi semprot
• KROMATOGRAFI KERTAS (KKT)

  Fasa diam dalam kromatografi kertas berupa air yang terikat pada selulosa kertas, sedangkan fasa geraknya berupa pelarut organik dan air (campuran). Membentuk system kromatografi cair-cair.
• KKT : FASE GERAK

  1. N-butanol-Asam asetat glasial-Air (4:1:5), didiamkan selama 24 jam (ambil lap. Atas).
  2. Asam asetat 10%
  3. Forestal (As. Asetat-Air-HCl (30:10:3), didiamkan 15 jam
  4. TBA (t-butanol-As. Asetat- Air (3:1:1), didiamkan 24 jam
• KROMATOGRAFI KOLOM (KK)

  Berdasarkan fase GERAK yang digunakan, dapat dibedakan menjadi :

  1. Kromatografi Padat cair;
  2. Kromatografi Padat cair;
  3. Kromatografi Cair cair (k.partisi);
  4. Kromatografi Gas cair.
• KROMATOGRAFI GAS CAIR (KGC)

  • Kolom: dikemas dengan fase diam (chromosorb W, celite). Fase diam disaputkan sebagai film pada permukaan kolom bagian dalam
  • Pemanasan kolom secara bertahap mulai 50oC sampai 350oC. Sampel dilarutkan dalam pelarut yg mudah menguap.
  • Aliran gas (nitrogen, argon) berperan dalam proses pemisahan senyawa dengan laju aliran gas yang terkontrol.
  • Detektor: Nyala ion atau tangkap electron atau dihubungkan dengan alat potensiometri.
  • Dapat menganalisis secara kualitatif juga kuantitatif.
• KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

  High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
• HPLC adalah jenis kromatografi yang paling banyak digunakan
• HPLC

  • Sensitivitasnya
  • Analisis kuantitatif yang akurat
  • Kemampuannya untuk memisahkan senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil secara termal
• HPLC dapat digunakan dalam sebagian besar analisis Kualitatif dan Kuantitatif
• HPLC : Fase Gerak

  Menggerakkan campuran melalui fase diam dengan bantuan pompa
• HPLC : Fase Stasioner

  • Salah satu komponen terpenting dari sistem HPLC
• HPLC : KOMPONEN

  A - Mobile Phase Reservoir

  B - Pump

  C - Sample Injector

  D - Column (Stationary Phase)

  E - Detector

  F - Data Analyser

  G - Waste Container

  
• DETEKSI SENYAWA: PENAPISAN FITOKIMIA

  • Metode dan peralatan yang sederhana
  • Cepat
  • Selektif
  • Memerlukan sampel sedikit tetapi dapat memberikan hasil yang baik (Limit deteksi)
  • Memberikan informasi keberadaan senyawa yang ada ataupun yang tidak ada dalam sampel
• PENAPISAN FITOKIMIA

  1. ALKALOID
  2. FLAVONOID
  3. SAPONIN
  4. KUINON
  5. STEROID
  6. TRITERPENOID
  7. TANIN
• 1. Reaksi Identifikasi Alkaloid

  • Pereaksi : Dragendorff dan Mayer
• 1. Reaksi Identifikasi Alkaloid

  • Positif palsu : penambahan pereaksi Dragendorff karena keberadaan golongan Kumarin yang dapat membentuk warna orange atau merah bata pucat
  • Uji konfirmasi : Sampel diteteskan pada kertas saring yng telah dicelupkan kedalam larutan KOH, diamati pada UV 366 nm, jika hasilnya teramati warna hijau kekuningan menandakan positif palsu dari Kumarin
• 1. Reaksi Identifikasi Alkaloid

  • Positif palsu : penambahan perekasi Mayer dapat terjadi dengan keberadaan protein tumbuhan.
  • Uji konfirmasi : Sampel yang telah direaksikan dengan Mayer dan terbentuk endapan putih kemudian ditambahkan etanol. Jika tetap ada endapan menandakan reaksi positif palsu dari protein
• 1. Reaksi Identifikasi Alkaloid

  • Negatif Palsu : Jenis alkaloid yang menghasilkan reaksi negatif palsu adalah alkaloid kuartener.
  • Uji konfirmasi : Alkaloid golongan ini tidak masuk kedalam pelarut organik, sehingga perlu diuji juga lapisan organiknya
• 2. Reaksi Identifikasi Flavonoid

  • Reaksi Cyanidin Willstatter yang dapat mendeteksi γ-benzopiron
  • Reaksi positif palsu dapat terjadi yang diberikan dari golongan kuinon.
  • Pada prosedur uji flavonoid
  • reaksi positif : jika lapisan amil alkohol berwarna kuning, orange, jingga. Lapisan air diambil dan ditambahkan NaOH. Hasilnya jika warna larutan tidak berubah maka flavonoid positif, jika larutan berubah warna menjadi merah, maka kuinon positif
• 3,4 Reaksi Identifikasi Saponin dan Kuinon

  • Saponin merupakan suatu glikosida yang terdiri dari bagian gula dan bagian non gula.
  • Ekstrak air simplisia dikocok vertikal selama 1 menit, terbentuknya busa yang stabil dengan tinggi 1 cm dan ketika ditambahkan HCl busa tetap stabil
  • Kuinon bereaksi dengan suatu basa (NaOH atau KOH) akan memberikan warna larutan menjadi merah.
• 3,4 Reaksi Identifikasi Saponin dan Kuinon

  • Reaksi positif palsu dapat diberikan oleh flavonoid dan tanin.
  • Tanin memiliki monomer flavan-3-ol dan flavonoid memiliki -OH pada C4.
  • Uji konfirmasi : Pada sampel yang bereaksi positif tannin, terbentuk endapan. Filtratnya ditambahkan NaOH, jika berwarna merah kuinon positif.
• 5,6. Reaksi Identifikasi Steroid / Triterpenoid

  • Steroid/titerpenoid merupakan salah satu aglikon dari saponin.
  • Syarat penting harus ada OH pada C3 dan khusus untuk steroid harus memiliki cincin spiroketal diatas.
• 5,6. Reaksi Identifikasi Steroid / Triterpenoid

  • Perekasi Liebermann Buchard komposisinya Asetat anhidrida dan H2SO4 (1:1)
  • Asetat anhidrida berfungsi untuk menarik air dari lingkungannya
  • H2SO4 berfungsi sebagai oksidator yang jika ada –OH pada C3 akan membentuk ikatanrangkap yang baru
  • Steroid akan memberikan warna Biru-Hijau
  • Triterpenoid akan memberikan warna merah-violet
• 7. Reaksi Identifikasi Tanin

  Simplisia diekstraksi dengan air, filtrat ditambahkan :

  1. FeCl3 akan bereaksi positif jika terjadi perubahan warna (+) tanin
  2. Gelatin, terbentuk endapan putih (+) tannin
  3. Perekasi Steasny akan terbentuk endapan pink (+) tannin katekat, kemudian disaring. Filtratnya ditambahkan Na asetat dan FeCl3 jika membentuk warna biru-hijau gelap maka (+) tannin galat