P7

• Aglikon flavonoid

  • Memiliki sifat kimia yang sama seperti senyawa fenol
  • Agak asam sehingga dapat larut dalam suasana basa, tetapi mudah terurai
  • Bersifat polar, penting dalam pemilihan pelarut ekstraksi (Pelarut polar)

  
• Bagan Ekstraksi untuk isolasi Flavonoid

  Contoh

  
• Metode Pemisahan Flavonoid

  • Kromatografi Lapis Tipis
  • Kromatografi Kertas (Kertas Whatman 3MM)
  • Kromatografi Kolom

  
• Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas

  • Jumlah sampel / ekstrak / fraksi yang ditotolkan harus terukur
  • Menggunakan pipa kapiler yang terukur volumenya
  • Menggunakan fasa gerak berair, seperti BAW, TBA, Asam asetat 10%, Forestal dll
  • Kromatogram biasanya diamati di lampu uv 366 nm

  
• Kromatografi Kolom

  • Fase diam selulosa, silica atau dengan poliamide
  • Perbandingan sampel terhadap kemasan kolom biasanya rentang 1:20; atau 1:50
  • Untuk ekstrak kasar, gunakan kolom dengan diameter lebih besar agar jumlah sampel yang dipisahkan dapat lebih banyak

  
• Selulosa


  • Prinsipnya sama dengan kromatografi kertas
  • Bagus untuk memisahkan glikosida dari aglikonnya
  • Bagus memisahkan aglikon yang kurang polar
  • Kapasitas : Rendah

  
• Silika

  • Cocok memisahkan aglikon yang kurang polar
  • Isoflavon, Flavanon, Metil Flavon, Flavonol
  • Beberapa ada yang mencuci lebih dulu dengan HCl untuk menghilangkan besi agar menghindari terjerapnya flavonoid pada silica
  • Kapasitas : Menengah

  
• Poliamida


  • Cocok memisahkan semua flavonoid
  • Diayak agar ukuran partikel yang seragam
  • Dicuci terlebih dahulu dengan metanoldan air
  • Kapasitas : Tinggi

  
• Gel Sephadex

  • Memisahkan campuran berdasarkan ukuran molekul, pelarut biasanya air
  • Molekul besar akan terelusi terlebih dulu
  • Gel harus dikembangkan dahulu dalam pengelusi selama 12 jam
  • G-10 untuk molekul berBM 0-700
  • G-25 untuk molekul berBM 100-1500

  
• Gel LH-20

  • Dirancang khusus untuk pelarut organic
  • Cocok untuk pemurnian akhir aglikon flavonoid dan glikosida yang telah diisolasi dengan selulosa, silica atau poliamide
  • Pelarut umumnya metanol

  
• Penafsiran Warna bercak Flavonoid

  • Sinar Uv 366 nm sebelum diuapi NH3: Lembayung Gelap
  • Sinar Uv 366 nm setelah diuapi NH3: Kuning, hijau-kuning atau hijau
  • Setelah diuapi NH3, terjadi sedikit perubahan warna atau tanpa perubahan warna
  • Flourosensi biru muda: Menjadi flourosensi hijau-kuning atau hijau biru
  • Flourosensi kuning menjadi jingga atau merah
  • Hijau-kuning, hijau-biru, atau hijau menjadi tidak ada perubahan warna atau sedikit berubah
  • Merah jingga redup atau merah senduduk menjadi warna biru
  • Merah jambu atau flourosensi kuning menjadi warna biru

  
• Pereaksi semprot

  • Larutan Alumunium klorida 5%
  • Kompleks difenil-asam borat-etanolamin 1% dalam metanol
  • Asam sulfanilat yang terdiazotasi
  • Vanilin-HCl. Larutan vanilin 5% dalam etanol dicampur dengan HCl pekat (4:1)
• Ciri spektrum UV flavonoid

  Terdapat serapan yang kuat pada pita 1 pada rentang panjang gelombang 300-500 nm dan pita 2 pada rentang 240-285 nm

  
• Rentangan serapan spektrum UV-sinar tampak flavonoid


  • Flavon
  • Flavonol (3-OH tersubstitusi)
  • Flavonol (3-OH bebas)
  • Isoflavon
  • Isoflavon (5-deoksi-6,7-dioksigenasi)
  • Flavanon dan dihidroflavonol
  • Khalkon
  • Auron
  • Antosianidin dan antosianin

  
• Pereaksi geser


  • Pereaksi yang ditambahkan dalam larutan cuplikan untuk menentukan kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi
  • Secara tidak langsung berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol
  • Penambahan pereaksi geser atau pereaksi diagnostik, adanya hidroksilasi, glikolasi, metilasi dan asetilasi dapat mengubah karakter serapan dari senyawa flavonoid

  
• Langkah pekerjaan penggunaan pereaksi geser

  1. Larutan sampel flavonoid dalam metanol

  2. Larutan sampel diukur spektrumnya, untuk mendapatkan data panjang gelombang maksimum sampel (Pita 1 dan pita 2)

  3. Larutan sampel (no.2) ditambahkan beberapa tetes pereaksi NaMeO, kemudian diukur dengan spektro, setelah 5 menit dilakukan pengukuran ulang untuk menguji terjadi dekomposisi/penguraian

  4. Larutan sampel (2)

  
• Penggunaan pereaksi geser

  1. Larutan sampel flavonoid dalam metanol

  2. Larutan sampel diukur spektrumnya, untuk mendapatkan data panjang gelombang maksimum sampel (Pita 1 dan pita 2)

  3. Larutan sampel (no.2) ditambahkan beberapa tetes pereaksi NaMeO, kemudian diukur dengan spektro, setelah 5 menit dilakukan pengukuran ulang untuk menguji terjadi dekomposisi/penguraian

  4. Larutan sampel (2-3 mL) ditambahkan 6 tetes pereaksi AlCl3 sesegera mungkin diukur serapannya dengan spektro

  5. Larutan no.4 ditambahkan 3 tetes HCl, segera diukur serapannya

  6. Larutan stok sampel (no. 1) ditambahkan pereaksi Natrium asetat dengan sedikit pengocokan pada kuvet, sampai membentuk lapisan natrium asetat 2mm, larutan diukur segera dan setelah 2 menit diukur kembali untuk melihat terjadi penguraian atau tidak

  7. Larutan sampel no 6, kemudian ditambahkan asam borat setengah kali dari natrium asetat yang ditambahkan, campuran kemudian segera diukur serapannya dengan spektrofotometri uv-vis

  
• Spektrum NaOMe

  • Petunjuk sidik jari pola hidroksilasi dan mendeteksi gugus hidroksil yang lebih asam dan tidak tersubstitusi
  • Adanya pengurangan kekuatan spektrum setelah waktu tertentu menunjukan adanya gugus yang peka terhadap basa

  
• Spektrum NaOMe

  • Penambahan natrium metoksida pada flavon dan flavonol dalam metanol umumnya menghasilkan pergeseran batokromik untuk semua pita serapan. Walaupnun demikian pergeseran batokromik yang besar pada serapan pita I sekitar 40 – 65 nm tanpa penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus 4' – OH bebas
  • Flavonol yang tidak memiliki gugus 4'-OH bebas akan memberikan geseran batokromik karena memiliki gugus 3-OH
  • Jika suatu flavonol punya 3 dan 4'-OH bbas, maka spektrumnya dengan Na metoksida akan terdekomposisi
  • Pereaksi pengganti Na metoksida yang cocok adalah NaOH 2M dalam air

  
• Spektrum Natrium asetat

  • Natrium asetat merupakan basa lemah dan hanya akan mengionisasi gugus yang sifat keasamannya tinggi, khususnya untuk mendeteksi adanya gugus 7 – OH bebas
  • Natrium asetat hanya dapat mengionisasi isoflavon khusus pada gugus 7 – OH

  
• Spektrum Natrium asetat-asam borat

  • Menjembatani kedua gugus hidroksil pada gugus o-dihidroksi
  • Mendeteksi adanya gugus orto-dihidroksi
  • Adanya natrium asetat dan asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus orto hidroksil paa cincin B dan menunjukkan pergeseran batokromik pada pita serapan I sebesar 12 – 30 nm
  • Gugus orto hidroksil pada cincin A juga dapat dideteksi dengan efek natrium asetat dan asam borat
  • Adanya pergesaran batokromik sebesar 5 – 10 nm pada pita II menunjukkan adanya gugus orto hidroksi pada posisi C6 dan C7 atau C7 dan C8

  
• Spektrum AlCl3-HCl


  Pereaksi ini dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksi dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tidak tahan asam dengan gugus orto – hidroksi, perekasi ini dapat digunakan untuk mendetekasi kedua gugus tersebut

  
• Efek AlCl3

  • Gugus OH pada C3 dan C5 pada flavon dan flavonol membentuk komplek yang stabil dengan AlCl3
  • Kompleks antara AlCl3 dengan gugus orto-hidroksi lebih stabil dan penambahan asam menyebabkan dekomposisi
  • Kompleks antara AlCl3 dengan C-keto dan 3 atau 5-OH tetap stabil dengan adanya asam
  • Adanya gugus orto-hidroksi pada cincin B, jika penambahan asam pada kompleks AlCl3 menghasilkan pergeseran hipsokromik sebesar 30-40 nm pada pita I
  • Pergeseran batokromik pada pita I sebesar 35-55 nm (dalam AlCl3 / HCl) jika dibandingkan pita I dalam methanol, menunjukkan adanya 5-OH flavon atau flavonol 3-OH tersubstitusi

  
• Penambahan pereaksi geser atau pereaksi diagnostik, adanya hidroksilasi, glikolasi, metilasi dan asetilasi dapat mengubah karakter serapan dari senyawa flavonoid. Dengan melihat perubahan-perubahan ini maka dapat digunakan untuk memperkirakan struktur flavonoid.

  
• Secara tidak langsung berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol

  
• Ang ditambahkan dalam larutan cuplikan untuk menentukan kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi.