Replicação do DNA

• • É necessário copiar o DNA no timing certo para garantir que quando as células se dividem o património genético das células resultantes é o mesmo da célula inicial
  • Processo semiconservativo
• Eucariotas vs. Procariotas

  • o cromossoma circular das bactérias tem apenas uma origem de replicação
  • os cromossomas lineares dos eucariotas têm múltiplas origens de replicação que iniciam a replicação bidirecional de modo independente
• Empacotamento de DNA em eucariotas:

  • Histonas - proteínas carregadas positivamente à volta das quais o DNA está enrolado em nucleossomas
  • Cromatina - dinâmica, a posição dos nucleossomas não é fixa
  • Cromossoma
• A compactação da cromatina tem implicações ao nível da expressão genética:

  • Eucromatina - menos condensada, mais transcrição
  • Heterocromatina - mais condensada, menos transcrição


  Mecanismos que alteram a estrutura da cromatina:

  • movimento dos nucleossomas ao longo do DNA
  • modificação das histonas
  • substituição de histonas canónica pelas suas variantes
• Alelos:

  • versão de uma determinada região do cromossoma
  • podem existir vários alelos (sequências) possíveis para o mesmo gene
• Ocorre o “desmontamento” dos nucleossomas para que a maquinaria da replicação possa aceder ao DNA - cada nucleossoma contém 8 histonas
• Durante o processo de divisão celular, ocorre a replicação dos cromossomas, formando cromatídeos irmãos
• o DNA é sempre sintetizado na direção 5’ para 3’
• DNA polimerase – sintetiza as novas moléculas de DNA (5’-3’)

  Exonuclease ou endonuclease – remove os primers de RNA

  Single strand binding proteins – estabilizam o DNA de cadeia simples

  Sliding clamp – ajuda na processividade da DNA polimerase
• Helicase – separa as duas cadeias de DNA (quebra pontes de hidrogénio)

  Topoisomerase – permite o “desenrolamento” do DNA

  Primase – adiciona RNA primers
• DNA ligase – liga a cadeia de DNA (ligações fosfodiester)

  RPA - proteína de replicação A - estabiliza a cadeia simples

  RFC - fator de replicação C - complexo proteico de 5 subunidades

  PCNA - atua como fator de processividade para a DNA polimerase
• Garfo de replicação - estrutura que se forma dentro do núcleo durante a replicação do DNA

  Telómeros - formam uma cápsula no final dos cromossomas, contendo uma sequência de DNA único que se vai repetindo inúmeras vezes
• DNA polimerase:

  • α - síntese de primers e síntese inicial do DNA
  • Β, σ e μ - reparação do DNA
  • γ - único DNA polimerase mitocondrial
  • δ - síntese de lagging strand DNA
  • ε - síntese de leading strand DNA
  • η, ι e κ - reparação do DNA pela TLS
• Maturação dos fragmentos de Okazaki:

  • a DNA polimerase δ sintetiza DNA até e para lá da extremidade 5’ do fragmento de Okazaki adjacente, deslocando uma cauda 5’ de fita simples que contém o primer de RNA
  • a endonuclease Fen1 cliva a aba, deixando um corte simples na estrutura do DNA que é selado pela DNA ligase
• • a replicação de cada fragmento de Okazaki na cadeia descontínua começa com a inserção de um primer
  • quando o primer para o último fragmento de Okazaki é removido, não há como preencher a lacuna pela replicação convencional
  • desta forma, caso o cromossoma com a lacuna se replique, resultará num cromossoma mais encurtado
• Lagging strand - cadeia de síntese descontínua

  1. a primase sintetiza oligonucleótidos curtos de RNA (primers) copiados do DNA
  2. a DNA polimerase III estende o primer do RNA com o novo DNA
  3. a DNA polimerase I remove o RNA na extremidade 5’ do fragmento vizinho e preenche a lacuna
  4. a DNA ligase conecta fragmentos adjacentes
• Lagging strand - cadeia de síntese descontínua

  • a síntese ocorre na direção 5’-3’, mas em segmentos pequenos que são dirigidos para fora do garfo de replicação
  • vários primers de RNA ligam-se à cadeia no sentido 3’-5’ e iniciam a síntese de pequenos segmentos de DNA
• Leading strand - cadeia de síntese contínua

  • a nova cadeia é gerada de forma contínua pela DNA polimerase no sentido 5’ - 3’
  • como a DNA polimerase só pode adicionar bases na direção 5’-3’, a cadeia é sintetizada na direção do garfo de replicação
• Início da replicação:

  1. a replicação tem que ser coordenada nos vários cromossomas durante a fase S do ciclo celular
  2. proteínas específicas ligam-se na origem de replicação (ORC - complexo de reconhecimento de origem)
  3. são recrutados fatores de replicação que recrutam o complexo de helicase MCM, um complexo de pré-replicação no início da fase G1
  4. o complexo MCM é constituído pelas proteínas MCM 2 a MCM 7 que formam um hexâmero
  5. MCM vai ser ativado por fosforilação (ocorre da fase G1 para a S) e irá funcionar como helicase
• Início da replicação:

  6. a fosforilação permite a ligação das proteínas Cdc45 e Sld, permitindo a ligação do complexo GINS (necessário para o funcionamento da helicase MCM)

  7. ocorre a separação de 2 complexos de replicação: 1 MCM para cada lado

  8. após o desenrolar da cadeia pelo MCM, os RPA estabilizam a cadeia simples e são sintetizados os primers

  9. o RFC monta os PCNA e são recrutadas DNA polimerases
• Após a replicação são incorporadas histonas recicladas, que carregam os padrões de modificação “antigos”, o que tem influência na estrutura da cromatina e na expressão genética, e histonas novas
• Após a replicação do DNA verificou-se que os nucleossomas contêm tetrâmeros H3 a H4 com todas as histonas novas ou todas reutilizadas, aparecendo em ambas as cadeias ao acaso:
• • H2A-H2B reutilizadas podem ser incorporadas em nucleossomas contendo tetrâmeros H3-H4 todos novos ou todos reciclados
  • histonas H3 e H4 são as que sofrem a maioria das metilações (substituição de um grupo metilo sobre substratos)
  • a metilação do DNA ocorre em citosinas e adeninas
  • após a replicação, as cadeias novas são imediatamente metiladas, pelo que durante esse período é possível identificar a cadeia molde e a cadeia nova
• Histonas não recicladas:

  • os padrões de posicionamento de histonas metiladas (associadas a regiões de transcrição ativa e inativa) são mantidos após a replicação
  • o processo de modificação de histonas está coordenado com o timing de replicação, pois a cromatina mais ativa em termos de transcrição é replicada primeiro, e a cromatina replicada mais tarde é sobretudo heterocromatina
• Ação da telomerase:

  • a adição de cópias múltiplas de DNA não codificante no extremo 3’ representa uma estratégia para minimizar os riscos de replicação incompleta
• • TERT - telomerase reverse transcriptase
  • TERC - telomeric RNA component
  • Complexo Shelterin - conjunto de 6 proteínas conservadas que reconhecem o DNA telomérico e se ligam nesse local, deixando as extremidade teloméricas menos suscetíveis ao reconhecimento errado por parte da maquinaria de resposta a lesões do DNA
• • a estrutura dos telómeros pode corresponder a:
  • repeticões de DNA em tandem
  • proteínas protetoras (shelteriu)
  • t-loop (protege os cromossomas)
• • quando estão muito pequenos, os telómeros sinalizam a paragem da divisão celular e a apoptose
  • a maioria das células cancerígenas é capaz de ativar a telomerase
• • Telómeros longos - saudável, longevidade normal
  • Fatores que contribuem para o alongamento dos telómeros:
  • intrínsecos - telomerase, hormonas sexuais
  • extrínsecos - estilo de vida saudável, atividade física, exercício, níveis de stress reduzidos
• • Telómeros curtos - doenças relacionadas com a idade, longevidade reduzida
  • Fatores que contribuem para o encurtamento dos telómeros:
  • intrínsecos - divisão celular, idade, danos no DNA, inflamações
  • extrínsecos - estilo de vida (nutrição, fumar…), stress e depressão
• Erros na replicação do DNA:

  • deslizamento da cadeia - inserção ou deleção de um nucleótido
  • incorporação errada de bases - a DNA polimerase comete erros durante a replicação do DNA, mas corrige-os (proofreading 3’-5’)
  • a taxa de erro é maior na leading strand
  • a primase não tem função de proofreading, pelo que os primers de RNA estão mais sujeitos a erros do que os de DNA
• Reparação de mismatch:

  Ocorre quando os erros não são corrigidos durante a replicação

  1. o complexo de proteínas MSH2 e MSH8 ligam-se ao mismatch
  2. uma endonuclease corta uma cadeia filha não metilada em 2 posições em cada lado do mismatch
  3. a endonuclease digere o fragmento excisado, sendo a lacuna resultante preenchida por uma DNA polimerase (usando a cadeia mãe como modelo) e uma ligase, completando o processo de reparação
• Pol III holoenzima (holoenzima polimerase III):

  • principal complexo enzimático envolvido na replicação de DNA dos procariotas
  • tem 2 centros catalíticos, um para cada cadeia
  • tem várias proteínas acessórias
• DNA polimerase:

  • I - fragmentos de Okazaki - substitui os primers de RNA por DNA
  • III - replicação do DNA
  • II, IV e V - reparação do DNA - capacidade de direcionar a atividade da polimerase no garfo de replicação através das TLS
  • a atividade de exonuclease no sentido 3’ - 5’ de algumas DNA polimerases permite a correção de bases incorporadas erradamente
• Maturação dos fragmentos de Okazaki em procariotas:

  • a DNA polimerase III sintetiza DNA a partir da extremidade 3’ de um primer, até atingir o início do primer do fragmento de Okazaki anterior
  • quando a polimerase III alcança o primer, deixa o DNA e a polimerase I é recrutada
  • a DNA polimerase I remove o primer de RNA no sentido 5’-3’ e a sua polimerização de nucleótidos preenche o espaço vazio com DNA
  • a lacuna na estrutura do DNA entre o final deste fragmento e o início do próximo é unida pela DNA ligase, que é inicialmente recrutada para o local pela ligação ao sliding clamp
• Início da replicação do DNA em procariotas:

  1. ligação da proteínas DNA A a uma região específica do DNA (DNA A box)
  2. início do desenrolamento e abertura da cadeia dupla de DNA na região rica em AT
  3. as proteínas de DNA A ligam-se a outras DNA A boxes mais acessíveis devido ao desenrolamento
  4. a helicase liga-se
  5. ocorre a formação do primossoma (composto pelo DNA helicase e pela DNA primase) após o recrutamento da primase
  6. após o recrutamento da holoenzima DNA polimerase III , forma-se o replissoma (composto por primossoma e 2 DNA polimerase III)