Controlo da expressão genética

• Controlo da expressão genética

  Os mecanismos de controlo de expressão dos genes podem ser locais ou específicos de um gene (ou um grupo restrito de genes) ou podem ser mais globais e afetar um conjunto mais alargado de genes
• Procariotas

  Ao nível da transcrição:

  • a célula precisa de mecanismos de ativação e repressão de genes
  • estas proteínas têm dois estados - um em que têm muita afinidade pelo DNA e outro em que não
  • algumas proteínas podem atuar simultaneamente como ativadores e repressores
• Procariotas

  Efetor alostérico:

  • liga-se à proteína reguladora, causando uma alteração da estrutura do seu domínio de ligação ao DNA
• Operão da lactose:

  • permease - transporta a lactose para dentro da célula
  • β-galactosidase - degrada a lactose em glucose e galactose
  • transacetilase - proteção em relação a substâncias alternativas que podem ser transportadas pela permease
  • repressor Lac - resulta da expressão do gene lacl e vai ligar-se ao operador
  • na ausência de lactose - ao ligar-se ao operador, o repressor impede a transcrição
  • na presença de lactose - a alolactose leva à indução do operão lac através de uma modificação alostérica do repressor
• Fatores sigma alternativos:

  • algumas respostas fisiológicas requerem a expressão coordenada de um elevado número de genes, em diversas localizações do genoma
  • isto ocorre durante a troca de fases de crescimento ou devido a condições ambientais
  • as técnicas de análise global da transcrição, permitem identificar os genes regulados por cada fator sigma
• Eucariotas

  • A regulação da expressão genética pode ocorrer em muitos níveis distintosAs grandes diferenças em relação aos procariotas são:
  • nível de condensação da cromatina
  • regulação do splicing
  • regulação do transporte do mRNA
  • como a RNA polimerase II é muito mais complexa, os eucariotas possuem uma maior capacidade de coordenar a transcrição e processamento do mRNA
• Estrutura da cromatina:

  • o acesso a vários genes é afetado pela organização do DNA e pela alteração química das histonas
• Iniciação da transcrição:

  • a regulação da frequência da iniciação da transcrição permite um maior controlo da expressão genética
• Splicing do RNA:

  • a expressão genética pode ser controlada pela alteração da taxa de splicing em eucariotas
  • o splicing alternativo consegue produzir múltiplos mRNAs a partir de um gene
• Silenciamento de genes:

  • as células conseguem silenciar genes com siRNAs, cortando-os das sequências invertidas que se dobre em duas hélices
  • siRNAs ligam-se ao mRNA e bloqueiam a sua tradução
• Síntese proteíca:

  • muitas proteínas participam no processo de tradução
  • a regulação da sua disponibilidade altera a taxa de expressão genética, acelerando ou retardando a síntese proteíca
• Modificação pós-traducional:

  • a fosforilação ou outras modificações químicas podem alterar a atividade da proteína após a sua produção
• Enhancers - elementos de regulação positiva, localizados a montante do local de início da transcrição, que são reconhecidos por fatores de transcrição que vão atuar como ativadores de transcrição
• Controlo da expressão genética através de um complexo mediador:

  • o dobramento do DNA permite que numerosos ativadores que estão ligados a sequências intensificadoras se aproximem do aparelho de transcrição
  • complexo mediador - complexo multiproteico que serve de interface entre os ativadores ou repressores e a RNA polimerase
  • o mediador vai estabilizar a ligação da RNA polimerase II ao promotor
• Modelação da transcrição:

  • é possível através de vários domínios característicos das proteínas reguladoras
• • domínio de ligação ao DNA – reconhece a sequência reguladora do DNA
  • domínio de interação com outras proteínas da maquinaria de transcrição - com a RNA polimerase ou outra proteína associada à RNA polimerase
  • domínio de interação com proteínas ligadas a outras sequências reguladoras - ação cooperativa na regulação da transcrição
  • domínio que influencia a estrutura da cromatina
  • domínio que funciona como sensor das condições fisiológicas da célula
• Como manter a expressão dos genes do cromossoma X em níveis comparáveis entre machos e fêmeas?

  • a compensação de dosagem é o processo pelo qual os organismos equalizam a expressão de genes entre membros de diferentes sexos biológicos
  • entre as espécies, os diferentes sexos são frequentemente caracterizados por diferentes tipos e números de cromossomos sexuais
• Como manter a expressão dos genes do cromossoma X em níveis comparáveis entre machos e fêmeas?

  • a fim de neutralizar a grande diferença na dosagem genética produzida por diferentes números de cromossomos sexuais entre os sexos, vários ramos evolutivos adquiriram vários métodos para equalizar a expressão genética entre os sexos
  • diferentes linhagens desenvolveram diferentes mecanismos para lidar com as diferenças nos números de cópias genéticas entre os sexos que são observadas nos cromossomos sexuais
• Mamíferos placentários - Inativação aleatória de um cromossoma X feminino:

  • as fêmeas desativam de forma aleatória um dos cromossomas X em todas as células do seu corpo para igualar a expressão do único cromossoma X masculino
  • heterocromatização progressiva em todo o cromossomo induzida por RNA Xist
• Xic (X-inactivation center) - a sua transcrição origina o ncRNA (non-protein-coding RNA) Xist, que se liga ao longo do cromossoma e recruta complexos proteícos de modificação das histonas que conduzem à formação da heterocromatina
• Mamíferos placentários - Inativação aleatória de um cromossoma X feminino:

  1. quando o gene Xist se expressa, o RNA liga-se e reveste o cromossoma X do qual é transcrito
  2. a RNA polimerase II liga o Xist ao Xi
  3. a onda inicial de silenciamento leva ao recrutamento de camadas adicionais de modificação epigenética, estabilizando ainda mais a estrutura heterocromática
  4. a proteina inativadora do cromossoma X é transferida para a cromatina
  5. o Xist RNA é degradado para prever a difusão
• Transcrição duplicada do cromossoma X masculino:

  • os machos aumentam em duas vezes a transcrição do seu único cromossoma X para corresponder à expressão feminina dos dois cromossomas X
• Transcrição diminuída de ambos os cromossomas X em hermafroditas:

  • os vermes hermafroditas C.elegans expressam ambos os cromossomos X pela metade para corresponder aos vermes machos com apenas um cromossomo X
• Enzimas de restrição ou endonucleases

  • representam um mecanismo de defesa usado pelas bactérias para se defenderem da infeção por vírus
  • as enzimas de restrição clivam o DNA em sequências específicas
  • a clivagem não ocorre no DNA da própria bactéria porque este se encontra protegido por metilação
• Nomenclatura de endonucleases:

  • nome da espécie de onde foi isolada - primeira letra do nome do género e primeiras duas letras da espécie
  • estirpe
  • ordem de identificação
• Endonucleases:

  1. o vírus injeta DNA para o interior da bactéria
  2. a endonuclease de restrição liga-se ao DNA viral
  3. o DNA viral sofre clivagem, sendo inativado
• Clivagem com extremos cegos:

  • a enzima realiza a clivagem no mesmo local na dupla cadeia de modo a que as cadeias sejam exatamente do mesmo tamanho
• Clivagem com extremos coesivos:

  • a enzima realiza a clivagem em sítios diferentes numa cadeia e noutra
  • quando se afastam os extremos há uma cadeia maior que a outra
• Conhecendo a sequência do DNA, podemos prever o tamanho dos fragmentos gerados por uma dada enzima de restrição

  1. extração do DNA
  2. digestão com enzima de restrição
  3. isolamento do fragmento de DNA de interesse
• Clonagem de DNA

  Podemos clonar fragmentos de DNA provenientes de uma digestão ou de um PCR, com vários objetivos diferentes:

  • isolar um fragmento de DNA de interesse
  • isolar diferentes fragmentos de uma mesma amostra – construção de bibliotecas de genes
  • sequenciação
  • expressão de uma proteína
• Clonagem de DNA

  1. construção de uma molécula de DNA recombinante
  2. transporte da molécula para a célula hospedeira
  3. multiplicação da molécula de DNA recombinante
  4. divisão da célula hospedeira
  5. divisões celulares numerosas, resultando num clone
• Vetores de clonagem

  Os vetores de clonagem normalmente incluem genes de resistência a antibióticos e locais de reconhecimento para várias enzimas de restrição (MCS)

  Vetor de clonagem - insere uma sequência de DNA num vetor; insere o vetor em células para a replicação do mesmo

  Vetor de expressão - permite a transcrição, tradução e conformação da proteína
• Plasmídeos:

  • DNA circular com replicação independente do cromossoma
  • inclui um gene que confere resistência a um dado antibiótico
  • multiple cloning site (MCS)
  • clonar DNA resultante de uma digestão é mais fácil se a enzima de restrição utilizada deixar extremos coesivos
  • são utilizados quando o objetivo é produzir uma dada proteína
• Bacteriófagos:

  • vírus que infetam bactérias
  • permitem a clonagem de fragmentos maiores que os plasmídeos
• Transformação bacterial:

  • processo de introdução de DNA livre na célula
  • as células têm que estar competentes para receber DNA - tratamento com cloreto de cálcio aumenta a permeabilidade das células ao DNA
• Eletroporação:

  1. é aplicado um impulso elétrico com uma voltagem otimizada durante apenas alguns milissegundos
  2. ocorre um rearranjo na parte interior da camada fosfolipídica da bactéria que forma pequenos poros que permitem a entrada do plasmídeo
• Conjugação:

  • transferência direta de DNA entre duas células
  • uma célula funciona como dadora e outra célula como recetora de DNA
  • não é uma troca recíproca
  • alguns plasmídeos contêm informação genética que permite a sua transferência de uma célula dadora para uma célula recetora através de uma ligação física entre células
• Conjugação:

  1. forma-se um pilus entre as duas células
  2. é produzida uma cópia de cadeia simples do DNA do plasmídeo na célula dadora
  3. a cópia passa para a bactéria recetora
  4. é utilizada como modelo, sendo convertida numa hélice de cadeia dupla
• Transdução:

  • o DNA é transferido entre bactérias por mediação viral
  • um bacteriófago pode transferir DNA entre bactérias

  1. aquando da sua assemblagem, a partícula viral inclui no seu DNA segmentos de DNA do hospedeiro
  2. estes segmentos são injetados num novo hospedeiro sendo inseridos no cromossoma do mesmo por recombinação
• • transdução generalizada - diversas zonas do genoma são transferidas
  • transdução especializada - apenas zonas específicas do genoma são transferidas