Tema 5 2

• Métodos de estudio de la microbiota marina: técnicas no dependientes de cultivo

  • Microscopía
  • Citometría de Flujo
  • Técnicas de Hibridación In situ
  • Amplificación selectiva y Secuenciación: PCR; DGGE; Técnicas NGS de Secuenciación
  • Principios del Análisis Metagenómico

  
• Microscopía de fluorescencia


  Detección específica de antígenos con anticuerpos marcados con fluoróforos para la Identificación de tipos celulares

  
• Inmunofluorescencia


  Empleo de anticuerpos conjugados con fluorocromos para marcar específicamente biomoléculas y estructuras subcelulares

  
• Inmunofluorescencia


  1. Se añade a la muestra un anticuerpo específico marcado con un fluorocromo

  2. Si la bacteria buscada (antígeno) está presente, el anticuerpo se unirá a ella y la marcará

  3. Después de retirar el exceso de anticuerpo, se observa al microscopio de fluorescencia

  4. Si se aprecian bacterias que emiten fluorescencia, deducimos que pertenecen a la especie buscada

  5. Se pueden añadir diferentes anticuerpos, para detectar distintas especies a la vez

  
• Inmunofluorescencia directa


  Se emplea un único anticuerpo marcado

  
• Inmunofluorescencia indirecta


  Se emplea un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado dirigido contra el anterior para proporcionar más señal fluorescente

  
• Inmunofluorescencia de E. coli, de actina, y de la proteína de reparación del ADN gH2AX con anticuerpos específicos marcados con fluoróforos


  • E. coli ΔclbR (colibactina neg.)
  • E. coli wt colibactina pos.)

  
• Inmunoensayos colorimétricos


  Empleo de anticuerpos conjugados con enzimas que originan producto coloreado

  
• Inmunoensayos quimioluminiscentes


  Empleo de anticuerpos conjugados con enzimas que originan producto luminiscente

  
• Inmunohistoquímica


  • Reacción colorimétrica en cortes histológicos del epitelio intestinal de Mytilus edulis infectado por Francisella noatunensis empleando anticuerpos específicos anti-Francisella noatunensis conjugados con fosfatasa alcalina

  
• Citometría de flujo


  Técnica de análisis celular multiparamétrico, que se puede combinar con fluorescencia para detectar, enumerar e identificar células microbianas en una muestra

  
• Citometría de flujo


  1. Las células fluyen alineadas de una en una por un microconducto atravesado por un haz de rayos Laser

  2. Un sistema de espejos y filtros dirige ambas señales luminosas hacia Detectores, que las convierten en señales eléctricas de intensidad variable según talla, forma y complejidad de cada célula

  3. Las señales, digitalizadas y procesadas en ordenador, generan gráficos y estadísticos sobre miles de células de la muestra
• Enfoque hidrodinámico


  Permite el paso individualizado de las células a través de la cámara de flujo en un flujo laminar
• Citometría de flujo


  • Dispersión de la luz
  • Intensidad de Fluorescencia

  
• Análisis multiparamétrico por citometría de microorgnismos del fitoplacton

  • Picoeukaryotes (<2 μm) y nanofitoplancton (2–10 μm) muestran intensidades de dispersión y fluorescencia más altas
  • El grupo Prochlorococcus (<1 μm) exhibe las intensidades de dispersión y de fluorescencia más bajas
  • El grupo Synechococcus (<1,5 μm) exhibe intensidades de dispersión y fluorescencia más altas que Prochlorococcus

  
• Parámetros de la citometría de flujo


  • Dispersión de la luz
  • Intensidad de Fluorescencia

  
• Dispersión de la luz


  1. Empleo de anticuerpos marcados con fluoróforos

  2. Anticuerpos específicos contra proteína X etiquetados con FITC

  3. Anticuerpos específicos contra proteína Y etiquetados con PE

  
• Intensidad de fluorescencia


  • Poca intensidad para FITC y PE
  • Alta intensidad para PE y baja para FITC
  • Alta intensidad para FITC y baja para PE
  • Alta intensidad para FITC y PE
• Análisis multiparamétrico por citometría de microorganismos del fitoplancton

  • Picoeukaryotes (<2 μm) y nanofitoplancton (2–10 μm) muestran intensidades de dispersión y fluorescencia más altas
  • El grupo Prochlorococcus (<1 μm) exhibe las intensidades de dispersión y de fluorescencia más bajas
  • El grupo Synechococcus (<1,5 μm) exhibe intensidades de dispersión y fluorescencia más altas que Prochlorococcus

  
• Hibridación in situ fluorescente (FISH)


  Técnica que se basa en el empleo de sondas de ADN marcadas fluorescentemente que hibridan con una secuencia de ADN o ARN denominada "oligonucleótido firma"

  
• Oligonucleótido firma


  • La secuencia de oligonucleótidos firma es característica de un grupo filogenético y está conservada dentro de ese grupo de organismos, siendo por tanto específica para los microorganismos que forman parte del mismo taxón
• Carl Woese (1977) creador de la nueva taxonomía molecular basada en la comparación entre especies de la secuencia del gen ARN ribosomal (ARNr) 16s y 18s
• Gen ARN ribosomal (ARNr) 16s y 18s


  • Están universalmente distribuidos en todos los seres vivos
  • Forman parte integral de la maquinaria de síntesis proteica básica de toda célula viva
  • Se han conservado durante el transcurso de la evolución
  • Presentan una variación en la longitud de la molécula adecuada para medir cualquier distancia filogenética
• El análisis de las secuencias de genes de ARNr se usa para poner de manifiesto relaciones evolutivas, de manera que se obtenía así la primera herramienta eficaz para la clasificación evolutiva de microorganismos
• Regiones variables del gen 16S rRNA

  • Se utilizan para la clasificación filogenética en género y especie
  • Alternan secuencias muy conservadas con regiones variables
• Técnica de hibridación in situ


  1. Se busca en una base de datos la secuencia diana de la especie de interés

  2. Se prepara la sonda (secuencia complementaria a la secuencia diana) en un sintetizador de oligonucleótidos

  3. Se marca la sonda con fluorocromos

  4. Se permeabilizan las bacterias de la muestra con un surfactante (detergente) para permitir la entrada de la sonda en la célula

  5. Se incuba la mezcla para que la sonda entre en la célula e hibride con su diana en los ribosomas (si la especie buscada está en la muestra)

  6. Se lava la muestra para retirar la sonda NO hibridada y se observa al microscopio de fluorescencia

  
• Técnica FISH


  • Simbiontes en branquias de mejillón gigante del Golfo de Méjico
  • Oligonucleótidos Firma para metanotrofos y bacterias sulforeductoras

  
• Técnica ISH (Hibridación In Situ) para microscopía electrónica


  1. Marcamos la sonda (oligonucleótido firma) con biotina

  2. Añadimos la sonda marcada al portaobjetos donde está el corte histológico y lavamos para retirar la sonda no hibridada

  3. Tratamos el corte con un anticuerpo anti-biotina que va unido a una enzima (ej. fosfatasa alcalina) y lavamos de nuevo

  4. Añadimos el sustrato de la enzima