ELFO a western blotting

• imunizace každého zvířete má svůj vlastní protokol
• zpracování a optimalizace protokolu

  • zisk protilátky
  • otestování protilátky s antigenem navázaným na nosič
  • použití sekundární protilátky
  • zpracování biologického vzorku
  • separace, vhodné naředění protilátek, vizualizace, zpracování záznamu
• Elektroforéza a Western blotting

  Zavádíme imunodetekci

  
• Doručení nové protilátky

  Začíná optimalizace

  
• Imunizace každého zvířete má svůj vlastní protokol
• Produkce Ab v 10 vajíčkách je srovnatelná s 1 králíkem
• 1 slepice dokáže ve vajíčkách vyprodukovat až 42 g protilátek

  
• 1 slepice může meziročně nahradit až 20 králíků nebo 4 kozy nebo 4 ovce
• Zavádění a optimalizace protokolu

  1. Získání protilátky

  2. Otestování protilátky s antigenem navázaným na nosič (BSA, KLH)

  3. Použití vhodné sekundární protilátky

  4. Zpracování biologického vzorku

  5. Separace, nalezení vhodného ředění protilátek, vizualizace, zpracování záznamu

  
• Gelová elektroforéza

  • Pro analýzu proteinů: polyakrylamidový gel
  • Stupeň zesítění gelu ovlivňuje velikost pórů, malé póry – gelová filtrace
  • Proteiny putují gelem s různou pohyblivostí (náboj, tvar a velikost molekuly)

  
• % T

  Celková koncentrace akrylamidu (Total), tj. AA + BIS
• % C

  Podíl crosslinkeru vůči celkové koncentraci akrylamidu, tj. BIS/(AA+BIS) *100%
• Princip SDS-PAGE v redukčních podmínkách

  • Redukce disulfidových vazeb
  • Vazba s dodecylsíranem sodným (SDS)
  • Udělení jednotného záporného náboje
  • Protein putuje k anodě
• ANODA


  Česky ANO, Rusky ano = DA (да), 2x ano –> takže je to kladné ☺
• Nanášení vzorků na ztuhlý gel

  1. Vzorky v jamkách

  2. Sestavená aparatura připravená k zapojení

  
• Barvení proteinů na gelu

  • Coomassie Brillian Blue (G250, R250)
  • Reakce s dusičnanem stříbrným, označuje se jako barvení stříbrem
  • A různé modifikace základních způsobů vizualizace s různou citlivostí, náročností...

  
• Citlivosti běžně používaných metod vizualizace proteinů na gelech

  • Stříbro
  • Coomassie Blue
  • SYPRO Ruby
  • CyDye

  
• Postup prací při Western blotu

  1. Příprava membrány

  2. Příprava aparatury

  3. Transfer proteinů z gelu na membránu

  4. Rozložení aparatury

  5. Vizualizace membrán

  
• NC nebo PVDF


  Membrány používané pro Western blot

  
• Tank nebo semidry blot

  Způsoby transferu proteinů z gelu na membránu

  
• Způsoby vizualizace membrán

  • Ponceau S
  • Amidočerň
  • Protilátky

  
• Proteiny jsou záporně nabité (díky SDS) -> putují k anodě!
• Složení kazety – důležité je pořadí gelu a membrány
• Blokování membrán pomocí proteinů

  1. Zabránění nespecifickým vazbám protilátek na membrány

  2. Po WB se membrána blokuje roztokem proteinů

  3. Roztok proteinů nesmí poškodit navázané proteiny (např. proteasy nejsou vhodné)
• Vysoké pozadí na membráně může být způsobeno špatnou blokací, špatnou protilátkou nebo špatným ředěním sekundární protilátky
• Běžně se používá blokování proteiny i detergenty: oplachovací roztoky obsahují oboje
• Nejčastěji používaný detergent: SDS (cena x výkon)
• Detekce proteinů monoklonální vs. polyklonální protilátky

  Monoklonální protilátka váže pouze jeden epitop, polyklonální váže více epitopů
• Postup Western blottingu

  • Příprava vzorku
  • ELFO
  • Transfer
  • Vazba protilátek
  • Detekce
  • Záznam
  • Zpracování dat
  • Zavedení protokolu pro novou protilátku

  
• Stripování membrán

  1. Cílem je odmýt navázanou protilátku z membrány bez vymytí cílených proteinů

  2. Stripovací roztok: směs detergentů, redukčních činidel, změn pH, teplota

  3. Po stripování je často re-blokace nespecifických skupin na membráně
• Výsledkem stripování je čistá membrána připravená k vazbě s jinou protilátkou

  
• Dot blotting

  Bez separace, antigen se přímo kape na membránu, promytí balastu, vazba primární protilátky, rychlé a vhodné pro optimalizaci WB – ředění protilátky, výběr substrátu pro sekundární protilátku

  
• Dot blotting je metoda vizualizace antigenu bez předchozí separace
• Protilátka funguje i při velkém zředění (1:1600)

  
• Příprava protilátek s označením CRK a CFN
• Proč používat Western blotting

  • Výzkum – postranslační modifikace, detekce, kvantifikace
  • Klinické aplikace (např. detekce protilátek proti borelióze)