10

• Počítání krevních buněk na hematologických analyzátorech

  Možnosti počítání krevních částic: mikroskopicky, počítací komůrky (Bürkerova komůrka), analyzátory krvinek

  
• Poloautomaty


  Manuální předředění vzorku
• Automaty


  Automatické ředící systémy
• Hematologické analyzátory


  • CBC
  • CBC + DIF
  • CBC + DIF + RET
  • CBC + DIF + RET + NRBC
  • CBC + DIF + RET + NRBC + CD znaky
• Aspirační módy


  • Manuální (otevřený x uzavřený systém)
  • Automatický – v kazetách (uzavřený systém)
• Aspirační objem


  20 μl až 200 μl vzorku (dle typu analyzátoru)
• Výkon


  • CBC: 100 – 150 vzorků/hod
  • CBC + DIF: 75 – 120 vzorků/hod
  • CBC + DIF + RET: 45 – 70 vzorků/hod
• Hematologické analyzátory


  • Vydávají rychle a přesně informace o počtech erytrocytů, leukocytů a trombocytů a další odvozené parametry
  • Krevní obraz s pětipopulačním diferenciálním rozpočtem leukocytů patří k základnímu vyšetření u řady onemocnění
  • Analyzátor upozorňuje na patologie v krevním obraze- v tom případě nutno provést nátěr na sklíčko a zkontrolovat nález mikroskopicky

  
• Měření krevních buněk


  1. Aspirace vzorku krve

  2. Hydrodynamická fokusace (unášení jednotlivých buněk proudem kapaliny – jedna za druhou)

  3. Naředění vzorku krve speciálním ředicím roztokem

  4. Rozdělení suspenze buněk do 2 cest: počítání RBC, PLT nebo počítání WBC, HGB

  
• Impedanční metoda


  Měření odporu při průchodu el. proudu
• Impedanční metoda


  • Naředěná suspenze krevních částic je vháněna do měřicí kyvety
  • Vně a uvnitř kyvety je polarizované stejnosměrné elektrické pole
  • Stejnosměrný proud nemůže pronikat do vnitřních struktur krevní buňky (záporný el. náboj buněčné membrány)
  • Buňka je stejnosměrným proudem obtékána
  • Po vniknutí částice do vstupního otvoru se změní měrný odpor prostředí a vybudí se určité napětí (vznikne napěťový impulz), které se měří na voltmetru
  • Tyto impulzy jsou dále počítačově zpracovávány a softwarově vyhodnoceny
  • Výsledkem jsou tzv. histogramy (dvojrozměrná distribuce počtu buněk v závislosti na jejich velikosti)
  • Počet impulzů = počet buněk
  • Velikost impulzů = objem buněk

  
• Optická metoda


  Princip průtokové cytometrie
• Optická metoda


  • Interakce buňky s laserovým paprskem
  • Detekce rozptýleného světla nebo fluorescence
  • Analýza ve směru 0° - počet buněk
  • Analýza rozptýleného světla - charakter buněk - velikost, komplexita (složení), granularita cytoplazmy a lobularita (členitost) jádra
  • Statistické zpracování a grafické znázornění do tzv. scattergramů
  • Oznámení atypických elementů ve formě „hlášek"(flags)
• Krevní obraz (KO)


  Základní laboratorní vyšetření pro diagnostiku a monitorování léčby řady onemocnění
• Odběr a příprava vzorku krve

  1. Odběr: žilní, kapilární, arteriální krev do zkumavky s K3EDTA, popř. K2EDTA (stabilita vzorku 5 h)

  2. Bezprostředně po odběru nelze krevní vzorek vyšetřit – vyčkat alespoň 15 minut, aby došlo k vzájemnému vyrovnání koncentračních gradientů vně a uvnitř krvinky, po aplikaci krve do zkumavky s antikoagulačním přípravkem

  3. Před vlastní analýzou nechat zkumavku 10 minut míchat na valivé míchačce
• Respektovat preventivní zásady vyšetření, zohledňovat výsledky předešlých vyšetření, přihlížet k souvisejícím informacím (věk, pohlaví, diagnóza, léčba pacienta)

  
• Červené krvinky (erytrocyty)


  Přímo měřené parametry: RBC, HGB, RDW

  Přímo měřené nebo vypočítané parametry: Hct, MCV

  Vypočítané parametry: MCH, MCHC

  
• Krevní destičky (trombocyty)


  Přímo měřené parametry: PLT, MPV, PDW, IPF

  Vypočítané parametry: Pct

  
• Bílé krvinky (leukocyty)


  WBC - počet leukocytů v 1 litru krve

  Diferenciální počet leukocytů: mikroskopicky, analyzátory krevních částic, digitální morfologie

  
• Diferenciální počet leukocytů (DIF)

  • Třípopulační diferenciál

  Pětipopulační diferenciál
• Beckman Coulter: VCS technologie

  • Umožňuje proměřit jednu buňku všemi třemi technologickými principy (impedanční metoda, vysokofrekvenční střídavé el. pole, rozptyl laserového paprsku) najednou v jednom měřicím systému
• Sysmex: Fluorescenční průtoková cytometrie


  • Kombinace průtokové fluorescenční cytometrie a rozptylu laserového paprsku

  Velikost úhlu rozptylu laserové paprsku je přímo úměrná velikosti buňky

  Intenzita bočního rozptylu laserové paprsku je přímo úměrná vnitřní struktuře buňky

  Intenzita fluorescenčního záření je přímo úměrná metabolické aktivitě buňky a nepřímo úměrná stupni vyzrálosti buňky

  
• Abbott: MAPSS technologie


  • Multi-Angle-Polarized-Scatter-Separation
• Cytochemické metody


  Metody založené na chemických reakcích, které umožňují detekci a lokalizaci různých buněčných komponent
• Imunofluorescenční metody


  Metody využívající fluorescenčně značené protilátky k detekci a lokalizaci různých buněčných komponent
• Příklady automatického měření diferenciálního počtu krvinek na různých analyzátorech

  • Beckman Coulter: VCS technologie
  • Sysmex: Fluorescenční průtoková cytometrie
  • Abbott: MAPSS technologie
  • Siemens: Perox metoda

  
• VCS technologie (Beckman Coulter)

  1. Měření objemu buňky

  2. Měření elektrické vodivosti buňky

  3. Měření rozptylu laserového paprsku
• VCS technologie (Beckman Coulter)


  • Umožňuje proměřit jednu buňku všemi třemi technologickými principy v jednom měřicím systému
• Fluorescenční průtoková cytometrie (Sysmex)


  1. Měření velikosti úhlu rozptylu laserového paprsku

  2. Měření intenzity bočního rozptylu laserového paprsku

  3. Měření intenzity fluorescenčního záření

  
• Fluorescenční průtoková cytometrie (Sysmex)

  • Velikost úhlu rozptylu laserového paprsku je přímo úměrná velikosti buňky
  • Intenzita bočního rozptylu laserového paprsku je přímo úměrná vnitřní struktuře buňky
  • Intenzita fluorescenčního záření je přímo úměrná metabolické aktivitě buňky a nepřímo úměrná stupni vyzrálosti buňky

  
• MAPSS technologie (Abbott)


  Detekce buněk pomocí polarizovaného světla (laserového paprsku) v úhlu 0°, 10°, 90° a 90°D
• MAPSS technologie (Abbott)


  • Úhel 0° - velikost buňky
  • Úhel 10° - komplexnost buňky
  • Úhel 90° - lobularita jádra
  • Úhel 90°D - granularita

  
• Perox metoda (Siemens)


  1. Cytochemické obarvení buněk na přítomnost myeloperoxidázy (MPO)

  2. Ozáření laserovým paprskem

  3. Hodnocení výsledného depolarizovaného světla

  
• Perox metoda (Siemens)


  • Rozptyl světla ke stanovení objemu buněk
  • Absorpce světla ke stanovení MPO aktivity buněk
  • Rozdílnost absorpce světla při různé aktivitě MPO - diferenciace buněk

  
• Analyzátor digitální morfologie (DM)

  Zařízení pro automatickou analýzu krevních nátěrů
• Analyzátor digitální morfologie (DM)

  1. Jednotka podavače sklíček

  2. Optická část (mikroskop a digitální fotoaparát)

  3. Klasifikační software
• Analyzátor digitální morfologie (DM)

  • Výkon: 35 - 40 nátěrů za hodinu (periferní krev, tělní tekutiny)
  • Možnost nastavení libovolného počtu WBC pro celkovou analýzu
  • Automatické provedení analýzy, mikroskopické zhodnocení a fotografické zaznamenání jednotlivých typů buněk
  • Rozdělení buněk do předdefinovaných skupin WBC
  • Vyhodnocení i buněk, které do WBC nepatří (normoblasty, makrotrombocyty, rozpadlé buňky, artefakty)

  
• Stanovení retikulocytů na hematologických analyzátorech

  1. Oddělení frakce retikulocytů od jiných elementů s obsahem RNA

  2. Obarvení buněk barvivem, které se váže k RNA

  3. Detekce intenzity prošlého a odraženého světla po průchodu strukturou retikulocytu

  4. Detekce intenzity fluorescence dané množstvím fluorescenční barvy navázané na RNA v retikulocytech

  
• Retikulocyty podle stupně zralosti

  • Starší formy s nízkou fluorescencí (LFR)
  • Mladší formy se střední (MFR) a vysokou fluorescencí (HFR)

  
• Stanovení normoblastů na hematologických analyzátorech

  1. Optická analýza

  2. Fluorescenční metoda (fluorochrom specifický pro DNA)

  3. Cytochemická metoda