TRAnscription processamiento

• Testes Genéticos pré-implantação (PGT)

  • PGT-M - Preimplantation Genetic Testing for Monogenic diseases
  • PGT-SR - Preimplantation Genetic Testing for chromosomal Structural Rearrangements
  • PGT-A - Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

  
• Diagnóstico genético pré-implatação


  1. Estimulação da produção de óvulos e sua recolha

  2. Fertilização in vitro - Injeção intracitoplasmática de espermatozóides

  3. Extração (laser) de uma célula dos embriões com cerca de 5 dias, na fase de blastocisto, e vitrificação dos embriões

  4. Avaliação dos resultados do estudo genético, um embrião saudável será transferido para o útero

  5. Monitorização e confirmação da gravidez

  
• Biópsia a um blastocisto


  Amostra de 5-10 células da camada celular externa, designada por trofoectoderme, a partir da qual se formará a placenta
• Técnicas de Biologia Molecular envolvidas

  • PCR
  • FISH
  • Gene array
  • NGS
• Início da transcrição pela RNA polimerase II


  • Existe um conjunto de factores gerais de transcrição que se associam à RNA polymerase II (TF-transcription factors)
  • Os elementos de regulação a montante (upstream) aumentam a eficiência de ligação da RNA polimerase. A estes elementos ligam-se fatores de transcrição específicos (para determinados genes) que contactam com os fatores gerais (TF)

  
• Enhancers


  • Sequências envolvidas na regulação da expressão genética (promovem o início da transcrição)
  • Podem estar a montante (upstream) ou a jusante (downstream) do promotor

  
• Elongação da transcrição pela RNA polimerase II


  1. A libertação da RNA polimerase II da região do promotor requer vários fatores de transcrição e a fosforilação do CTD (carboxyl tail domain)

  2. Todos os TF, excepto o TFIIH são libertados

  3. Durante a elongação o CTD está sempre perto do mRNA que está a ser sintetizado e esta proximidade permite a modelação de modificações ao RNA

  
• Final da transcrição em eucariotas

  Mais complicado e menos bem bem definido que para procariotas, contudo pensa-se que para a RNA polimerase II, o final da transcrição está associado ao sinal funcional poli(A)

  
• Diferenças na transcrição entre procariotas e eucariotas

  • Procariotas: Ocorre no citoplasma, RNA polimerase única e com um número inferior de subunidades, Fator sigma para início da transcrição, Promotor -35 e -10
  • Eucariotas: Ocorre no núcleo, RNA polimerase I, II e III, RNA polymerase IV e V-plantas, Início da transcrição envolve variados factores de iniciação, TATA box (-25)

  
• mRNA - RNA mensageiro

  • Contém sequências não codificantes, para além da região codificante
  • mRNA policistrónico - Genes que codificam proteínas que funcionam juntas, são frequentemente contíguos no genoma
  • mRNA monocistrónico - Expressão sob o controlo de um único promotor

  
• Processamento do mRNA em eucariotas

  • CAP no extremo 5' - Ligação de 7-metilguanosina ao transcrito, protege o mRNA de degradação e é necessário para a tradução
  • Splicing - Remoção de intrões
  • Cauda poli (A) no extremo 3' - Após o sinal AAUAAA ou AUUAAA, o extremo 3' é excisado por uma endonuclease e são adicionados 150 a 200 adeninas, importante para o transporte, estabilidade e tradução
  • O domínio carboxi-terminal (CTD) tem um papel importante no processamento do mRNA, pois serve de local de ligação para as proteínas necessárias ao capping, splicing e clivagem seguida de poliadenilação

  
• Capping do mRNA


  Adição de uma guanosina trifosfato (GTP) com adição de um grupo metilo na posição 7 (7-metilguanosina). Distingue o mRNA dos restantes tipos de RNA e é importante para o transporte do mRNA para o citoplasma

  
• Splicing do mRNA


  O mRNA antes do processamento inclui regiões codificantes (exões) e regiões não codificantes (intrões), que têm que ser removidos antes da tradução

  
• Splicing alternativo do mRNA

  • O mesmo pré-mRNA transcrito pode ter diferentes splicings, e assim originar diferentes mRNAs, consoante o tecido onde o mRNA está a ser produzido, ou o estádio de desenvolvimento
  • Tipos de eventos de splicing alternativo: Omissão de exões, Retenção de intrões, Alternância nos locais de splicing, Exões de exclusão mútua, Promotores alternativos, Poliadenilação alternativa

  
• Reconhecimento das fronteiras entre intrões e exões no pré-mRNA

  Nucleótidos específicos indicam os limites do intrão: GU no extremo 5' e AG no extremo 3'. Uma adenina a 15-45 nucleótidos a montante do extremo 3' também é típico (branch point). As sequências em redor destes nucleótidos também é bastante conservada

  
• Splicing alternativo


  Presença de promotores alternativos, região codificante do transcrito pode iniciar-se com o exão 1a ou 1b

  
• Tipos de eventos de splicing alternativo

  • Omissão de exões
  • Retenção de intrões
  • Alternância nos locais de splicing
  • Exões de exclusão mútua
• No pré-mRNA (ou transcrito primário) é necessário reconhecer a fronteira entre intrões e exões

  
• Nucleótidos específicos que indicam os limites do intrão

  GU no extremo 5' e AG no extremo 3'. Uma adenina a 15-45 nucleótidos a montante do extremo 3' também é típico (branch point)

  
• Sequência típica do branch point

  YNYYRAY (Y indica uma pirimidina, N indica qualquer nucleótido e R indica uma purina)
• Spliceossoma


  snRNPs (U1, U2, U4, U5 e U6) e proteínas

  
• Formação do Spliceossoma


  1. U1 snRNPs liga-se ao local de splicing 5'

  2. U2 snRNPs liga-se ao local branch point

  3. U4/U6–U5 tri-snRNP são recrutadas

  4. U1 é libertada e posteriormente a U4 também

  5. Justaposição do local de splicing 5' e do branch point e ocorre a primeira reacção catalítica

  6. Os exões 5' e 3' alinham-se em U5 e ocorre a segunda reacção catalítica

  
• Reações de transesterificação no splicing

  1. Reacção 1 – o extremo 5' do intrão (local dador) liga-se ao branch site

  2. Reacção 2 – ligação dos dois exões

  
• A RNA polimerase tem um papel fundamental no splicing, gerindo a sua velocidade de processamento nas regiões terminais dos exões

  
• Proteínas SR


  Ligam-se ao mRNA, nas sequências exónicas, e ajudam a posicionar a U1 e U2 nos locais corretos

  
• Importância de "exon definition" nas espécies em que os intrões são muito longos (por oposição a "intron definition" em espécies em que os intrões são mais curtos)
• Splicing enhancers e splicing silencers


  Proteínas SR (splicing enhancers) e proteínas hnRNP (splicing silencers) que se podem ligar a intrões e exões e regular o splicing alternativo

  
• mRNA trans-splicing


  Processo raro em que o mRNA final resulta de splicing que ocorre entre 2 transcritos primários

  
• mRNA self-splicing


  Primeira vez que uma molécula não-proteína foi descrita a catalisar uma reação, requer a formação de várias estruturas em loop no mRNA

  
• Group I introns


  Encontrados em genes de mitocôndrias e cloroplastos, e ocasionalmente em bactérias e bacteriófagos

  
• Group II introns


  Encontrados nos organelos de fungos e plantas e ocasionalmente em procariotas

  
• Estudos recentes indicam que os exões humanos são predominantemente autónomos
• Poliadenilação do mRNA


  1. Reconhecimento de uma sequência sinal no mRNA (AAUAAA) e uma região rica em GU

  2. Cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF) liga-se à sequência AAUAAA e o cleavage stimulation factor (CST) liga-se à região rica em GU

  3. Formação do complexo de poliadenilação que cliva o mRNA e adiciona a cauda poli(A)

  
• Edição do mRNA, um processo raro
• Exemplo de edição do mRNA no gene que codifica a apolipoproteína B: edição de C para U, com mudança de leitura do respetivo codão (que passa a ser um codão stop)