TRANSCRIPCION

• RNA


  Moléculas tipicamente de cadeia simples, o que confere uma maior flexibilidade em termos de estrutura tridimensional
• As moléculas de RNA contêm uracilo (em vez de timina)
• O uracilo também pode estabelecer ligações U-G (na estrutura secundária do RNA e não durante a transcrição)
• Transcrição - do DNA ao RNA


  1. lncRNA (long noncoding RNA) in eukaryotes - dosage compensation; imprinting

  2. sRNA (small RNA) in bacteria - anneal to their target mRNAs and stabilize or degrade them

  
• A maior parte do RNA de uma célula é rRNA, seguido de tRNA. O mRNA representa uma parte muito pequena do RNA total da célula
• Fases da transcrição


  1. Iniciação

  2. Elongação

  3. Terminação

  
• As diferentes fases da transcrição (iniciação, elongação e terminação) são semelhantes entre procariotas e eucariotas, no entanto existem diferenças

  
• RNA polimerase - sintetiza RNA no sentido 5'-3', usando como molde uma das cadeias do DNA

  
• Promotor


  Região do DNA importante para o início da transcrição

  
• A "força" de um promotor depende de quão eficaz é o reconhecimento das regiões -35 e -10 pelo factor sigma

  
• Os genes que codificam proteínas muito abundantes têm promotores mais fortes, ou seja, mais perto da sequência consenso reconhecida pelo fator sigma

  
• UTR


  Untranslated region
• Subunidades da RNA polimerase em procariotas

  • 2 subunidades maiores β e β' (beta)
  • 2 subunidades menores α (alpha)
  • 1 subunidade ω (omega)
  • 1 fator σ (sigma)

  
• RNA polimerase em procariotas

  • Subunidade β - activa na síntese
  • Subunidade β' - liga-se ao DNA
  • Subunidades α - promovem as interações com proteínas reguladoras
  • Subunidade ω - estabiliza a enzima e ajuda na sua assemblagem; regulação da expressão genética

  
• Diferentes factores sigma reconhecem diferentes promotores, o que permite direcionar a RNA polimerase para diferentes conjuntos de genes, de acordo com a fase de crescimento ou condições ambientais

  
• Fatores sigma


  • Primário (σ70)
  • ECF (extra cytoplasmatic function) (σE)

  
• Existem factores anti-sigma que sequestram os fatores sigma quando estes não são necessários
• Elongação da transcrição em procariotas

  1. Bolha de transcrição - provoca alterações na torção da molécula de DNA (DNA girases e topoisomerases são envolvidas no processo para gerir a tensão do enrolamento)

  2. A velocidade de transcrição (cerca de 40 nucleótidos/seg) é muito menor que a velocidade de replicação do DNA

  
• Terminação intrínseca (ou Rho-independente) em procariotas

  1. A sequência do terminador leva à síntese de regiões complementares que vão originar um hairpin no mRNA

  2. O terminador consiste em duas regiões complementares (invertidas), separadas por aproximadamente 10 bases, seguidas de uma repetição de adeninas

  3. Quando a RNA polimerase atinge o hairpin, pausa, e como a ligação U-A é muito fraca, a ligação da RNA polimerase ao DNA termina

  
• Terminação Rho-dependente em procariotas

  1. A proteína Rho é um hexâmero que reconhece uma sequência no mRNA rica em C e pobre em G

  2. Rho vai provocar alterações alostéricas na RNA polimerase e leva à terminação

  
• Tipos de RNA polimerase em eucariotas


  • RNA polimerase I - Transcrição de rRNAs (excepto 5S rRNA)
  • RNA polimerase II - Transcrição de mRNAs e outros pequenos RNAs
  • RNA polimerase III - Transcrição de tRNAs, 5S rRNA e outros pequenos RNAs

  
• Início da transcrição pela RNA polimerase I

  1. A síntese de rRNA pela RNA polimerase I está localizada numa região particular do núcleo designada por nucléolo

  2. O promotor da RNA polimerase I tem regiões ricas em G/C, reconhecidas pela UBF1

  3. Após a ligação de UBF1 e SL1, a RNA polimerase I liga-se com a ajuda de fatores de transcrição (TF-transcription factors)

  
• Início da transcrição pela RNA polimerase III

  1. Os promotores para o 5S rRNA e tRNA localizam-se na região transcrita (excepção)

  2. Estão envolvidos vários fatores de transcrição (TF-transcription factor)-TFIIIC e TFIIIB- sendo que o TFIIIB é muito importante para o posicionamento da RNA polimerase no local correto

  
• Início da transcrição pela RNA polimerase II

  1. Formação do complexo de pré-iniciação, com a ligação da proteína TBP (TATA binding protein) à TATA box, que em seguida recruta outros factores de transcrição e a RNA polimerase II

  2. Uma das subunidades da RNA polimerase II tem um domínio carboxi-terminal (CTD-carboxy terminal domain) que é fosforilado para se dar o início da fase de elongação

  
• Elementos reguladores a montante (upstream) na transcrição pela RNA polimerase II

  • Aumentam a eficiência de ligação da RNA polimerase
  • Ligam-se fatores de transcrição específicos (para determinados genes) que contactam com os fatores gerais (TF)

  
• Enhancers


  • Sequências envolvidas na regulação da expressão genética (promovem o início da transcrição)
  • Podem estar a montante (upstream) ou a jusante (downstream) do promotor

  
• Início da transcrição pela RNA polimerase II


  • Existe um conjunto de factores gerais de transcrição que se associam à RNA polymerase II (TF-transcription factors)
  • Os elementos de regulação a montante (upstream) aumentam a eficiência de ligação da RNA polimerase. A estes elementos ligam-se fatores de transcrição específicos (para determinados genes) que contactam com os fatores gerais (TF)

  
• Enhancers


  • Sequências envolvidas na regulação da expressão genética (promovem o início da transcrição)
  • Podem estar a montante (upstream) ou a jusante (downstream) do promotor

  
• Elongação da transcrição pela RNA polimerase II


  1. A libertação da RNA polimerase II da região do promotor requer vários fatores de transcrição e a fosforilação do CTD (carboxyl tail domain)

  2. Todos os TF, excepto o TFIIH são libertados

  3. Durante a elongação o CTD está sempre perto do mRNA que está a ser sintetizado e esta proximidade permite a modelação de modificações ao RNA

  
• Final da transcrição em eucariotas

  Mais complicado e menos bem bem definido que para procariotas, contudo pensa-se que para a RNA polimerase II, o final da transcrição está associado ao sinal funcional poli(A)

  
• Diferenças na transcrição entre procariotas e eucariotas

  • Ocorre no citoplasma (procariotas) vs no núcleo (eucariotas)
  • RNA polimerase única e com um número inferior de subunidades (procariotas) vs RNA polimerase I, II e III, RNA polymerase IV e V-plantas (eucariotas)
  • Fator sigma para início da transcrição (procariotas) vs Início da transcrição envolve variados fatores de iniciação (eucariotas)
  • Promotor -35 e -10 (procariotas) vs TATA box (-25) (eucariotas)

  
• mRNA - RNA mensageiro


  • Contém sequências não codificantes, para além da região codificante
  • Pode ser policistrónico ou monocistrónico

  
• Processamento do mRNA em eucariotas

  • Cap no extremo 5' - Ligação de 7-metilguanosina ao transcrito
  • Splicing - Remoção de intrões
  • Cauda poli (A) no extremo 3' - Após o sinal AAUAAA ou AUUAAA, o extremo 3' é excisado por uma endonuclease e são adicionados 150 a 200 adeninas

  
• Capping do mRNA


  • Adição de uma guanosina trifosfato (GTP) com adição de um grupo metilo na posição 7 (7-metilguanosina)
  • Cap 0 (mais comum), Cap 1 (grupo metilo adicionado à ribose do primeiro nucleótido), Cap 2 (grupo metilo adicionado à ribose do segundo nucleótido)
• Splicing do mRNA


  • O mRNA antes do processamento inclui regiões codificantes (exões) e regiões não codificantes (intrões), que têm que ser removidos antes da tradução
  • Algumas vantagens deste processo

  
• Splicing alternativo do mRNA

  • O mesmo pré-mRNA transcrito pode ter diferentes splicings, e assim originar diferentes mRNAs, consoante o tecido onde o mRNA está a ser produzido, ou o estádio de desenvolvimento
  • Tipos de eventos de splicing alternativo: Omissão de exões, Retenção de intrões, Alternância nos locais de splicing, Exões de exclusão mútua, Promotores alternativos, Poliadenilação alternativa

  
• Reconhecimento das fronteiras entre intrões e exões no pré-mRNA

  Nucleótidos específicos indicam os limites do intrão: GU no extremo 5' e AG no extremo 3'. Uma adenina a 15-45 nucleótidos a montante do extremo 3' também é típico (branch point). As sequências em redor destes nucleótidos também é bastante conservada

  
• Splicing alternativo


  Presença de promotores alternativos, região codificante do transcrito pode iniciar-se com o exão 1a ou 1b

  
• Tipos de eventos de splicing alternativo

  • Omissão de exões
  • Retenção de intrões
  • Alternância nos locais de splicing
  • Exões de exclusão mútua
• No pré-mRNA (ou transcrito primário) é necessário reconhecer a fronteira entre intrões e exões