Transcripcion y PROCESAMIENTO RNA

• Início da transcrição pela RNA polimerase II


  1. Existe um conjunto de factores gerais de transcrição que se associam à RNA polymerase II (TF-transcription factors)

  2. Os elementos de regulação a montante (upstream) aumentam a eficiência de ligação da RNA polimerase. A estes elementos ligam-se fatores de transcrição específicos (para determinados genes) que contactam com os fatores gerais (TF)
• Enhancers


  Sequências envolvidas na regulação da expressão genética (promovem o início da transcrição). Podem estar a montante (upstream) ou a jusante (downstream) do promotor
• Elongação da transcrição pela RNA polimerase II


  A libertação da RNA polimerase II da região do promotor requer vários fatores de transcrição e a fosforilação do CTD (carboxyl tail domain). Todos os TF, excepto o TFIIH são libertados. Durante a elongação o CTD está sempre perto do mRNA que está a ser sintetizado e esta proximidade permite a modelação de modificações ao RNA
• Final da transcrição em eucariotas

  Mais complicado e menos bem bem definido que para procariotas, contudo pensa-se que para a RNA polimerase II, o final da transcrição está associado ao sinal funcional poli(A)
• Diferenças na transcrição entre procariotas e eucariotas

  • Ocorre no citoplasma (procariotas) vs no núcleo (eucariotas)
  • RNA polimerase única e com um número inferior de subunidades (procariotas) vs RNA polimerase I, II e III, RNA polymerase IV e V-plantas (eucariotas)
  • Factor sigma para início da transcrição (procariotas) vs Início da transcrição envolve variados factores de iniciação (eucariotas)
  • Promotor -35 e -10 (procariotas) vs TATA box (-25) (eucariotas)
• mRNA - RNA mensageiro


  Contém sequências não codificantes, para além da região codificante. Pode ser policistrónico ou monocistrónico
• mRNA - Processamento em eucariotas

  • CAP no extremo 5' (protege o mRNA de degradação e é necessário para a tradução)
  • Splicing (remoção de intrões)
  • Cauda poli (A) no extremo 3' (importante para o transporte, estabilidade e tradução)
• Capping do mRNA


  Adição de uma guanosina trifosfato (GTP) com adição de um grupo metilo na posição 7 (7-metilguanosina). Distingue o mRNA dos restantes tipos de RNA e é importante para o transporte do mRNA para o citoplasma
• Splicing do mRNA


  O mRNA antes do processamento inclui regiões codificantes (exões) e regiões não codificantes (intrões), que têm que ser removidos antes da tradução
• Splicing alternativo do mRNA

  O mesmo pré-mRNA transcrito pode ter diferentes splicings, e assim originar diferentes mRNAs, consoante o tecido onde o mRNA está a ser produzido, ou o estádio de desenvolvimento

  
• Tipos de eventos de splicing alternativo

  • Omissão de exões
  • Retenção de intrões
  • Alternância nos locais de splicing
  • Exões de exclusão mútua
  • Promotores alternativos
  • Poliadenilação alternativa
• mRNA splicing


  É necessário que no pré-mRNA (ou transcrito primário) seja reconhecida a fronteira entre intrões e exões. Nucleótidos específicos indicam os limites do intrão: GU no extremo 5' e AG no extremo 3'. Uma adenina a 15-45 nucleótidos a montante do extremo 3' também é típico (branch point). As sequências em redor destes nucleótidos também é bastante conservada

  
• Splicing alternativo


  Presença de promotores alternativos, região codificante do transcrito pode iniciar-se com o exão 1a ou 1b
• Tipos de eventos de splicing alternativo

  • Omissão de exões
  • Retenção de intrões
  • Alternância nos locais de splicing
  • Exões de exclusão mútua
• No pré-mRNA (ou transcrito primário) é necessário reconhecer a fronteira entre intrões e exões
• Nucleótidos específicos que indicam os limites do intrão

  GU no extremo 5' e AG no extremo 3'. Uma adenina a 15-45 nucleótidos a montante do extremo 3' também é típico (branch point)

  
• Sequência típica do branch point

  YNYYRAY (Y indica uma pirimidina, N indica qualquer nucleótido e R indica uma purina)
• Spliceossoma


  snRNPs (U1, U2, U4, U5 e U6) e proteínas
• Formação do Spliceossoma


  1. U1 snRNPs liga-se ao local de splicing 5'

  2. U2 snRNPs liga-se ao local branch point

  3. U4/U6–U5 tri-snRNP são recrutadas

  4. U1 é libertada e posteriormente a U4 também

  5. Justaposição do local de splicing 5' e do branch point e ocorre a primeira reacção catalítica

  6. Os exões 5' e 3' alinham-se em U5 e ocorre a segunda reacção catalítica
• Reações de transesterificação no splicing

  1. Reacção 1 – o extremo 5' do intrão (local dador) liga-se ao branch site

  2. Reacção 2 – ligação dos dois exões
• A RNA polimerase terá um papel fundamental no splicing, gerindo a sua velocidade de processamento nas regiões terminais dos exões
• Proteínas SR


  Ligam-se ao mRNA, nas sequências exónicas, e ajudam a posicionar a U1 e U2 nos locais corretos
• Exon definition


  Importante em espécies em que os intrões são muito longos (por oposição a "intron definition" em espécies em que os intrões são mais curtos)
• Splicing enhancers e splicing silencers


  Proteínas SR (Serine-arginine Repeat) e proteínas hnRNP (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particle) que regulam o splicing alternativo
• mRNA trans-splicing


  Processo raro em que o mRNA final resulta de splicing que ocorre entre 2 transcritos primários
• mRNA self-splicing


  Primeira vez que uma molécula não-proteína foi descrita a catalisar uma reação, requer a formação de várias estruturas em loop no mRNA

  
• Group I introns


  Encontrados em genes de mitocôndrias e cloroplastos, e ocasionalmente em bactérias e bacteriófagos
• Group II introns


  Encontrados nos organelos de fungos e plantas e alguns exemplos em procariotas
• Estudos recentes indicam que os exões humanos são predominantemente autónomos
• Poliadenilação do mRNA


  1. Reconhecimento de uma sequência sinal no mRNA (AAUAAA) e uma região rica em GU

  2. Cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF) liga-se à sequência AAUAAA e o cleavage stimulation factor (CST) liga-se à região rica em GU

  3. Formação do complexo de poliadenilação que cliva o mRNA e adiciona a cauda poli(A)
• Edição do mRNA, um processo raro
• Exemplo de edição do mRNA no gene que codifica a apolipoproteína B: edição de C para U, com mudança de leitura do respetivo codão (que passa a ser um codão stop)