Laboratorio

• Tecnologie ricombinanti


  L'insieme di procedure tecnologiche che, attraverso la manipolazione del DNA, consentono l'analisi di differenti prodotti genici ed eventualmente di regolarne l'espressione anche in contesti allotipici

  
• Caratteristiche del genoma e il macchinario di regolazione

  • Organizzazione dei geni e dei genomi
  • Meccanismi che regolano l'espressione genica

  
• Espressione genica

  1. Trascrizione

  2. Traduzione

  3. Regolazione a livello di RNA

  4. Regolazione a livello di proteina

  
• DNA ricombinante


  DNA proveniente da due o più origini diverse, combinato insieme. Molecole ibride di DNA

  
• Clonaggio del DNA


  Metodo per produrre molte copie di un frammento specifico di DNA, quale ad esempio un gene d'interesse

  
• Procedura di clonaggio del DNA

  1. Isolare il DNA da clonare

  2. Tagliare il DNA in frammenti

  3. Tagliare il plasmide (vettore) batterico circolare

  4. Unire i frammenti di DNA con i frammenti di plasmide per generare molecole di DNA ricombinante

  5. Introdurre le molecole ricombinanti in cellule batteriche

  6. Identificare i batteri contenenti i plasmidi ricombinanti

  7. Isolare i plasmidi dalle colture batteriche e analizzare i frammenti di DNA amplificati

  
• Applicazioni del clonaggio del DNA

  • Determinare la sequenza di geni
  • Determinare le sequenze regolatrici
  • Studiare la funzione dei geni
  • Studiare la regolazione dei geni
  • Studiare il prodotto dei geni
  • Manipolare i geni e/o la loro regolazione

  
• Applicazioni pratiche del DNA ricombinante

  • Terapia genica
  • Diagnosi di malattie genetiche
  • DNA fingerprinting in medicina legale
  • Produzione di farmaci
  • Generazione di ceppi batterici, animali e piante geneticamente modificati

  
• Plasmidi


  Molecole naturali isolate nei procarioti che ci permettono di replicare la molecola ricombinante all'interno dei batteri stessi

  
• Caratteristiche fondamentali dei plasmidi

  • Origine di replicazione
  • Presenza di siti unici per enzimi di restrizioni
  • Presenza di una o più marche di selezione

  
• Clonaggio di un gene di interesse in un vettore plasmidico

  1. Identificare il veicolo o plasmide

  2. Estrarre il DNA dalla cellula contenente il gene di interesse

  3. Frammentare il DNA utilizzando lo stesso enzima di restrizione utilizzato per aprire il vettore

  4. Unire il vettore aperto e il frammento di DNA

  
• Enzimi di restrizione


  Riconoscono e tagliano il vettore, possono essere utilizzati per aprire il vettore ed inserire il frammento da clonare
• Gli enzimi di restrizione sono presenti una sola volta perché sono siti unici di restrizione, l'enzima di restrizione taglia e riconosce solo una volta il plasmide per poter aprire senza frammentare il vettore
• Altro plasmide è pUC19

  
• MCS (Multiple cloning sequence)


  Regione dove sono presenti tutti i siti unici per gli enzimi di restrizione. Serve per aprire il vettore e inserire la sequenza di DNA da clonare

  
• Clonaggio di un gene di interesse in un vettore plasmidico


  1. Identificare il veicolo o plasmide

  2. Prendere la cellula contenete il DNA da clonare, lisare uccidere la cellula ed estrarre il DNA

  3. Frammentare il DNA utilizzando lo stesso enzima di restrizione utilizzato per aprire il vettore

  4. Unire il vettore aperto e il frammento di DNA sempre aperto

  5. Utilizzare la DNA ligasi per costituire un'unica molecola di DNA ricombinante

  6. Trasferire il plasmide ricombinante nella cellula ospite

  7. Isolare solo i batteri che hanno ricevuti i plasmidi

  8. Prendere i batteri trasformati e farli crescere in terreno liquido

  
• Preparazione del terreno di coltura per i batteri

  1. Pesare 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di NaCl

  2. Mettere in un becher contenete 950 ml di acqua deionizzata e mescolare

  3. Misurare il pH e aggiungere NaOH se necessario

  4. Portare a volume a 1 L

  5. Sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 121 gradi

  6. Aggiungere 15 g di bacto agar per ogni litro di terreno

  7. Sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 121 gradi

  8. Lasciare raffreddare il terreno e versare 25 ml circa in ogni piastrina
• Il terreno per coltura batterica descritto si chiama LB, ed è uno dei più utilizzati nei laboratori di ricerca
• Il passaggio di sterilizzazione in autoclave è fondamentale per eliminare ogni traccia di spore, muffe o batteri dal terreno
• Isolare e selezionare i ricombinanti

  1. Mettere insieme il vettore e la cellula ospite da clonare tagliate specificamente con lo stesso enzima di restrizione

  2. Utilizzare il vettore pUC19 che contiene il multiple cloning site all'interno del gene Lac Z'

  3. I ricombinanti sono i batteri che hanno ricevuto il plasmide che all'interno del gene Lac Z' presentano il frammento da clonare

  4. Prelevare i batteri ricombinati attraverso il pick up colonies

  
• Clonaggio dell'intero genoma


  1. Isolare il genoma da clonare

  2. Frammentare il genoma utilizzando un enzima di restrizione

  3. Unire il vettore con i frammenti del genoma

  4. Processamento da parte della DNA ligasi che forma una molecola di DNA ricombinante

  5. Trasformare le cellule ospiti con la miscela di molecole di DNA ricombinato

  6. Seminare su un terreno di selezione con antibiotici

  7. Prelevare i cloni attraverso pick up

  
• Clonaggio dell'intero genoma attraverso PCR

  1. Denaturare il DNA per separare i due filamenti

  2. Utilizzare inneschi complementari alla sequenza da clonare

  3. Far avvenire la reazione di interazione tra inneschi e sequenza complementare

  4. La polimerasi produce due nuovi filamenti di DNA

  
• La PCR permette di ottenere grandi quantità di molecole di DNA uguali che rappresentano il frammento da clonare

  
• Reazione di PCR


  1. Polimerasi sarà in grado di trovare questi inneschi e li utilizzerà come origine di replicazione del DNA andando a formare il DNA da clonare

  2. Questa reazione avviene a temperature più alte che dipendono dalle caratteristiche della polimerasi utilizzata (68-75)

  3. La polimerasi produce due filamenti di nuova sintesi

  4. Alla fine di un ciclo avremo che da una molecola inziale di DNA si ottengono due frammenti di DNA

  5. Ripetendo più cicli si ottengono grandi quantità di molecole di DNA che hanno la caratteristica di essere tutte uguali e rappresentano il frammento che si deve clonare

  
• Componenti necessari per la reazione di PCR

  • Regione di DNA da clonare
  • Inneschi stampo
  • Nucleotidi necessari per il funzionamento della polimerasi
  • Polimerasi termostabile perché deve poter sopravvivere ad alte temperature
• La reazione di PCR avviene all'interno di un termociclatore dove avviene un cambiamento continuo di temperatura
• Nel clonaggio classico è necessario frammentare tutto il genoma e poi individuare il frammento di interesse attraverso lo screeaning

  
• La PCR permette di isolare e amplificare solo il gene di interesse ottenendo al termine della reazione molte copie del gene di interesse

  
• Quando non si ha informazione su ciò che si vuole clonare si deve obbligatoriamente ricorrere a un clonaggio di tipo classico
• Caratteristiche delle molecole di DNA per essere utilizzate come vettore

  • Duplicazione indipendente dal genoma dell'ospite
  • Dimensioni limitate

  
• Marker di selezione


  Sono necessari perché la capacita delle cellule batteriche di internalizzare i plasmidi è bassa, per cui al termine di un processo di trasformazione si otterrà una miscela di batteri la cui maggior parte sarà costituita da batteri non trasformati

  
• Se si mettono a crescere tutti i batteri di un processo di trasformazione in un mezzo di coltura senza antibiotico tutte le cellule si moltiplicheranno sia quelle con il frammento di DNA che quelle senza

  
• Se al termine della trasformazione si selezionano soli i batteri trasformati con un antibiotico, il cui gene per la resistenza è presente nel vettore, alla fine della crescita batterica si otterranno solo batteri con il frammento di DNA clonato

  
• Plasmide integrato


  Un plasmide che prevede l'integrazione all'interno del genoma batterico

  
• Episoma


  Un plasmide che non si integra nel genoma batterico

  
• Non è utile utilizzare il plasmide episoma perché integrandosi il materiale genetico si duplica solo quando il batterio duplicherà sé stesso, si ha una resa molto bassa

  
• Caratteristiche dei plasmidi


  • Grandezza dei plasmidi si misura in kilo basi
  • Esistono plasmidi di diversa dimensione
  • Quelli più gradi sono presenti in numero contenuto di copi all'interno di una cellula
  • I più piccoli possono essere presenti in più copie
  • Tutti i plasmidi possiedono una serie di geni che codificano gli elementi necessari e sufficienti alla loro duplicazione e ripartizione tra le cellule figlie al momento della divisione cellulare

  
• Fago


  Virus che infettano specificamente cellule batteriche
• Un fago interagendo con una cellula ospite trasferisce il proprio materiale genetico in essa

  
• All'interno della cellula ospite il materiale genetico del fago si replica