genetica

• Estrazione degli acidi nucleici

  1. Rompere la membrana cellulare

  2. Allontanamento delle membrane

  3. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari

  4. Precipitazione alcoolica e purificazione

  5. Analisi qualitativa e quantitativa del DNA estratto

  
• Solubilizzazione delle membrane


  Le membrane sono un doppio strato lipidico che viene solubilizzato con dei detergenti che si inseriscono nel doppio strato lipidico e creano delle micelle
• Il DNA estratto non è integro, è frammentato
• Dimensioni del DNA estratto

  Frammenti che vanno dalle 50 alle 100 kilobasi (kb), non si ottengono frammenti di DNA più lunghi
• Principali tecniche di estrazione del DNA

  • Estrazione utilizzando una soluzione contenete fenolo e cloroformio
  • Estrazione utilizzando il "salting out"
  • Estrazione con kit commerciali
• Estrazione fenolo/cloroformio


  1. Fase di lisi cellulare

  2. Fase di separazione degli acidi nucleici dalle proteine utilizzando la soluzione di fenolo/cloroformio

  3. Precipitazione del DNA in etanolo assoluto in presenza di sali

  4. Lavaggio in etanolo 70%

  
• Estrazione "salting out"


  Prevede una lisi delle cellule mediante detergenti e trattamento con proteinasi K, le proteine vengono allontanate con una precipitazione usando una soluzione altamente salina

  
• Estrazione kit commerciali


  1. Utilizzo di membrane di silice su cui il DNA si può legare

  2. Separazione del DNA dal resto dei componenti cellulari usando una colonnina

  3. Lavaggio della membrana di silicio per eliminare i sali caotropici e la componente salina

  4. Eluizione del DNA dalla membrana
• Estrazione del DNA


  1. Lisi cellulare

  2. Separazione del DNA dal resto dei componenti cellulari usando una colonnina

  3. Centrifugazione o applicazione del vuoto per far passare la soluzione attraverso la membrana di silicio

  4. Lavaggio della membrana di silicio per eliminare i sali caotropici e la componente salina

  5. Aggiunta di acqua o soluzione di diluizione per far staccare il DNA dalla membrana
• Estrazione del DNA con biglie magnetiche

  1. Lisi dei componenti cellulari

  2. Utilizzo di biglie magnetiche che legano il DNA per affinità chimica

  3. Utilizzo di un magnete esterno per raccogliere le biglie sul lato della provetta

  4. Rimozione della soluzione mantenendo il magnete attaccato

  5. Lavaggio delle biglie con etanolo

  6. Utilizzo di una soluzione per far staccare il DNA dalle biglie magnetiche
• Quantificazione del DNA


  Utilizzo dello spettrofotometro per misurare l'assorbanza del DNA a 260 nm, che è in relazione lineare con la concentrazione del DNA

  
• Rapporto di assorbanza A260/A280


  Indica la contaminazione da proteine, deve essere > 1,8 per una buona estrazione di DNA
• Rapporto di assorbanza A260/A230


  Indica la contaminazione da carboidrati e fenolo, il valore ottimale è = 2,2

  
• Nanodrop


  Spettrofotometro comunemente usato in laboratorio per quantificare campioni di DNA usando microvolumi
• Conservazione del DNA


  • Temperatura bassa (-20/-70°C) per periodi lunghi
  • Evitare congelamento e scongelamento ripetuti
  • Concentrazione di DNA più alta = minore degradazione
• Analisi qualitativa del DNA estratto: elettroforesi


  1. Utilizzo di gel di agarosio per separare i frammenti di DNA in base alla lunghezza

  2. Applicazione di campo elettrico per far migrare i frammenti di DNA verso il polo positivo

  3. Utilizzo di soluzione intercalante per rendere visibili i frammenti di DNA sotto luce UV

  
• Mobilità elettroforetica del DNA

  Inversamente proporzionale al peso molecolare
• DNA che migra più lentamente è di dimensioni maggiori e meno degradato
• DNA estratto è più concentrato di quello necessario, quindi vanno fatte diluizioni
• Enzimi di restrizione


  Enzimi in grado di tagliare la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze palindromiche
• Il sistema di modificazione e restrizione dei batteri li difende dal DNA esogeno dei batteriofagi
• Il DNA batterico è protetto dalla metilazione dei siti di restrizione
• Sono stati isolati più di 1200 enzimi di restrizione che riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche palindromiche
• Enzima di restrizione


  Riconosce a livello della doppia elica di DNA la sequenza specifica ed è in grado di effettuare un taglio nella doppia elica lasciando delle estremità adesive (sticky ends) che sono asimmetriche, che vedono la presenza di un singolo filamento in entrambi i lati
• La sequenza che riconoscono gli enzimi di restrizione è una sequenza palindromica
• Metilazione


  Aggiunta di un gruppo metile che impedisce all'enzima di restrizione di riconoscere la sequenza e di tagliare, proteggendo il DNA batterico
• Sono stati isolati più di 1200 enzimi di restrizione che riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi
• Enzimi di restrizione


  • Hae 3 (GGCC)
  • EcoR1 (GAATTC)
  • Not 1 (GCGGCCGC)
• Tipi di estremità generate dal taglio con enzimi di restrizione

  • Taglio piatto (Rsa1)
  • Estremità sporgenti (EcoR1)
  • Estremità sporgenti (Kpn1)
• Per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nucleotidi si avrà in media un taglio ogni 256 nucleotidi, per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi si avrà in media un taglio ogni 4096 nucleotidi
• Enzimi di restrizione


  • Alu1 (AGCT, frequenza = 1/256 pb)
  • EcoR1 (GATTC, frequenza = 1/4096 pb)
• Digestione di DNA plasmidico con enzimi di restrizione


  1. DNA plasmidico da solo (10 kb)

  2. DNA plasmidico digerito con BamH1 (linearizzato, 10 kb)

  3. DNA plasmidico digerito con EcoR1 (2 frammenti da 7 kb e 3 kb)
• Digestione di DNA genomico con enzimi di restrizione

  DNA genomico digerito con EcoR1 (smear di frammenti)
• Ibridazione


  Appaiamento di due molecole di DNA o RNA complementari
• Denaturazione


  Processo che fa venir meno le forze che tengono insieme le basi azotate, rendendo il DNA a singolo filamento
• Sonda


  Sequenza specifica complementare al DNA bersaglio, più corta del target, che permette di evidenziarne la presenza e/o la quantità
• Temperatura di melting (Tm)


  Temperatura alla quale il 50% della sequenza è ancora ibridata con il filamento complementare, mentre il restante 50% è a singolo filamento
• La Tm dipende dalla composizione in basi della sonda, dalla lunghezza della sonda e dalla concentrazione salina

  
• Stringenza dell'ibridazione


  Specificità con cui la sonda si lega (si ibrida) ad una determinata sequenza bersaglio
• Condizioni di ibridazione ad alta stringenza

  • Maggiore temperatura
  • Minore concentrazione salina
  • Presenza di denaturanti chimici