Technique d’étude d’interaction molec

• Introduction


  1. Liaisons stables - liaisons transitoires (cross-link)

  2. Notion de Kd

  3. Liens moléculaires

  4. Démarche expérimentale
• Liaisons stables


  • Toute association donnant naissance à un complexe que l'on peut isoler
• Liaison transitoire


  • Liaison entre une enzyme et son substrat, souvent des liaisons très fugaces donnant naissance à des complexes trop peu stables pour que l'on puisse les isoler
• Notion de Kd


  La force de la liaison (affinité) est définie par des paramètres d'équilibre et en particulier par le Kd ou constante de dissociation
• Kon : constante de vitesse de formation du complexe
• Koff : constante de vitesse de dissociation du complexe
• Kd = [A] [B] / [AB] = koff / kon = 1 / Ka (constante d'association)
• Quelques exemples de Kd

  • Interaction streptavidine / biotine : 10-14 M
  • Interaction Antigène / Anticorps : 10-8 à 10-10 M pour un bon anticorps, 10-6 M pour un anticorps plus faible
  • Histone / ADN 10-11 M
• Liens moléculaires


  • Les interactions protéine / protéine sont possibles grâce à la formation de liaisons non covalentes
• Types de liaisons


  • Liaisons ioniques
  • Liaisons hydrogène
  • Liaisons hydrophobes
  • Forces de Van Der Waals
• Interactions = "interactome"
• Interactions des protéines entre elles et avec d'autres macromolécules biologiques (acides nucléiques)
• Démarche expérimentale


  1. S'assurer que la protéine appartient à un complexe, déterminer la taille de ce complexe

  2. Isoler le complexe

  3. Ident
• Atomes voisins


  • Interactions = « interactome »
  • Interactions des protéines entre elles et avec d’autres macromolécules biologiques (acides nucléiques)
• Démarche expérimentale


  1. S’assurer que la protéine appartient à un complexe, déterminer la taille de ce complexe

  2. Isoler le complexe

  3. Identifier les protéines de ce complexe

  4. Valider l’interaction in vitro, in vivo

  5. Caractériser l’interaction
• Méthode permettant s’assurer que la protéine appartient à un complexe et de déterminer la taille de ce complexe

  Chromatographie d’exclusion (voir précédemment) appliquée à l’étude des interactions protéine/protéine: Détermination de la masse apparente d’une protéine. (à comparer avec sa masse molaire calculée à partir de la séquence). État monomérique ou mutimérique de la protéine en solution. Incubation de la protéine cible avec un extrait protéique. Si une protéine de l’extrait interagit de manière stable avec la protéine cible, le complexe sera plus gros et passera plus vite dans la colonne que la protéine isolée. Complexe >> estimation de la taille de ce complexe. La protéine cible peut être marquée (par exemple à l’aide d’un fluorophore) pour faciliter sa détection. Technique essentiellement utilisée pour dire si la protéine est présente sous la forme d’un monomère ou d’un complexe. On peut également dissocier le complexe et analyser ses différents constituants.
• Méthodes permettant d’isoler un complexe protéique

  Chromatographie d’affinité (voir précédemment). Co - immunoprécipitation. Utilisation d’une résine sur laquelle est greffée de la protéine A, qui a une affinité pour le fragment Fc des Ac. Incubation de l’extrait avec un Ac spécifique de la protéine cible. Ajout de la protéine A-sépharose> liaison du complexe Ac-prot cible-partenaire. Élution du complexe (chauffage > gel de polyacrylamide, force ionique, peptide compétiteur…).
• Identification des protéines du complexe

  Séparation de ces protéines. Gel 1D, 2D (dénaturant, de type SDS-PAGE). Identification des protéines. Western blot. Microséquençage (EDMAN). Digestion trypsique / Spectroscopie de Masse
• Vérification de l’interaction in vivo

  FRET (Förster / Fluorescence Resonance Energy Transfer) -technique
• Séparation de ces protéines

  Gel 1D, 2D (dénaturant, de type SDS-PAGE)
• Identification des protéines


  1. Western blot

  2. Microséquençage (EDMAN)

  3. Digestion trypsique / Spectroscopie de Masse
• Vérification de l’interaction in vivo

  1. FRET (Förster / Fluorescence Resonance Energy Transfer)

  2. Double-hybride
• FRET (Förster / Fluorescence Resonance Energy Transfer)


  Processus non radiatif par lequel de l’énergie d’un fluorophore donneur à l’état excité est transmis à un fluorophore accepteur à proximité immédiate (distance < 10 nm)
• La détection de la nouvelle fluorescence indique que le donneur et le receveur ont été très proches l'un de l'autre (efficacité du FRET proportionnelle à l'inverse de la puissance 6 de la distance entre les deux molécules)
• La distance à laquelle le transfert est efficace à 50% est appelée distance de Förster et varie selon les agents fluorescents utilisés (ici : 50A°)
• Changement conformationnel
• Dimérisation/interaction
• Permet de savoir où et quand les molécules d’intérêt agissent dans la cellule
• Ces interactions peuvent être suivies en temps réel grâce à une caméra jointe au microscope à fluorescence
• Des résultats négatifs ne permettent pas d’affirmer que les molécules d’intérêt n’interagissent pas
• Cette technique suppose un niveau d'expression élevé des molécules d’intérêt, ce qui peut perturber leur fonction et/ou la réponse cellulaire
• Caractérisation de l’interaction


  Détermination de quelle(s) partie(s) de la protéine X interagit avec la protéine Y. Découpage de la protéine en différents morceaux capables de se structurer dans l’espace indépendamment les uns des autres
• Selon l’angle d’incidence d’un faisceau de lumière polarisée monochromatique illuminant une interface transparente (du verre par ex.): une partie de la lumière incidente est réfléchie et l’autre est réfractée (cas général)
• aux capables de se structurer dans l’espace indépendamment les uns des autres
• Une partie de la lumière incidente est réfléchie et l’autre est réfractée (cas général) lors de l'incidence d'un faisceau de lumière polarisée monochromatique sur une interface transparente
• Toute la lumière incidente est réfléchie, et seule une composante électromagnétique de la lumière, l’onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde si une couche fine de métal, riche en électrons libres, est rajoutée sous le verre
• Le phénomène d'entrée en résonance des électrons du métal lorsqu'une onde évanescente traverse une couche fine de métal est appelé résonance plasmonique de surface
• Les signaux obtenus, mesurés en unités arbitraires (unités de résonance ou RU) sont proportionnels à la masse d’analyte (B) adsorbée à la surface (pour les protéines, 1 RU approximativement égal à 1 pg.mm-2)
• Phases d'immobilisation d'une protéine ligand sur un support (chip)

  1. Phase d’adsorption

  2. Phase de désorption

  3. Phase de régénération
• Principaux domaines d'application


  • Caractérisation d'anticorps monolonaux ou polyclonaux
  • Interaction entre ligand et récepteur
  • Transduction de signal
  • Oligosaccharides et molécules glycosylées
  • Biologie cellulaire
  • Biologie moléculaire