Biochimie

• Techniques d’étude des protéines

  • Basée sur ses caractéristiques intrinsèques: masse, forme, str. primaire, secondaire, tertiaire et peut-être quaternaire
  • Charge à un pH donné
  • Densité
  • Degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité
  • Localisation cellulaire et sub-cellulaire
  • Existence d’un marqueur facilitant son identification
• Purification d’une protéine


  1. Extraction

  2. Enrichissement par centrifugation différentielle

  3. Fractionnement
• Extraction


  1. Selon sa localisation, emploi d’un tampon de lyse respectant le pH

  2. Utilisation de techniques comme sonication, choc osmotique, ultrasons, lyse mécanique

  3. Utilisation d'inhibiteurs de protéases pour éviter la dégradation

  4. Maintien de la température à 4°C
• Enrichissement par centrifugation différentielle


  Certaines organelles de la cellule sont plus denses que d'autres, vitesse de centrifugation différente
• Fractionnement


  1. Différence de solubilité des protéines selon la concentration saline

  2. Utilisation de sulfate d’ammonium pour précipiter la protéine d’intérêt, concentrée par centrifugation

  3. Enlèvement du sulfate d’ammonium par dialyse

  4. Fractionnement par chromatographie sur colonne
• Chromatographie sur colonne


  1. Filtration sur gel (tamis moléculaire) pour séparation sur la taille

  2. Chromatographie par échanges d’ions pour séparation selon la charge

  3. Chromatographie d'interaction hydrophobe pour séparation selon l’hydrophobicité
• Chromatographie par échanges d’ions


  1. Résine portant des groupements + pour l'échange d'anions

  2. Utilisation d'un gradient salin pour séparer les protéines selon leur charge à un certain pH
• Chromatographie d'interaction hydrophobe


  1. Résines porteuses de groupements hydrophobes pour retenir les protéines hydrophobes

  2. Utilisation d'un gradient de sel pour l'élution
• Chromatographie de partage


  1. Migration de la phase mobile organique par capillarité sur un support poreux hydrophile

  2. Plus les molécules sont hydrophobes, plus elles se laissent entraîner par la phase mobile
• Chromatographie d’affinité


  Séparation selon l’affinité de la protéine pour un support particulier
• Techniques d’étude des Interactions moléculaires


  1. Introduction

  2. Notion de Kd

  3. Liens moléculaires

  4. Démarche expérimentale
• Liaisons stables


  • Toute association donnant naissance à un complexe que l’on peut isoler
• Liaison transitoire


  • Liaison entre une enzyme et son substrat, souvent des liaisons très fugaces donnant naissance à des complexes trop peu stables pour être isolés
• Notion de Kd


  La force de la liaison (affinité) est définie par des paramètres d’équilibre et en particulier par le Kd ou constante de dissociation
• Quelques exemples de Kd

  • Interaction streptavidine / biotine: 10^-14 M
  • Interaction Antigène / Anticorps: 10^-8 à 10^-10 M pour un bon anticorps, 10^-6 M pour un anticorps plus faible
  • Histone / ADN: 10^-11 M
• Liens moléculaires


  • Les interactions protéine / protéine sont possibles grâce à la formation de liaisons non covalentes
  • Liaisons ioniques - la plus forte des liaisons non covalentes
  • Liaisons hydrogène - l’énergie de liaison est moyenne
  • Liaisons hydrophobes - l’énergie de liaison est faible
  • Forces de Van Der Waals - interactions électrostatiques entre deux atomes voisins
• Interactions = « interactome ». Interactions des protéines entre elles et avec d’autres macromolécules biologiques (acides nucléiques)
• Démarche expérimentale


  1. S’assurer que la protéine appartient à un complexe, déterminer la taille de ce complexe

  2. Isoler le complexe

  3. Identifier les protéines de ce complexe

  4. Valider l’interaction in vitro, in vivo

  5. Caractériser l’interaction
• Caractériser l’interaction


  1. Quelle partie de la protéine X interagit avec la protéine Y

  2. Kd, kon, stoechiométrie de l’interaction

  3. Interactions moléculaires
• Quelle partie de la protéine X interagit avec la protéine Y

  Interactions moléculaires mises en jeu – structure 3D
• Quelle partie de la protéine X interagit avec la protéine Y

  Kd, kon, stoechiométrie de l’interaction
• Chromatographie d’exclusion appliquée à l’étude des interactions protéine/protéine

  1. Détermination de la masse apparente d’une protéine

  2. État monomérique ou mutimérique de la protéine en solution

  3. Incubation de la protéine cible avec un extrait protéique

  4. Si une protéine de l’extrait interagit de manière stable avec la protéine cible, le complexe sera plus gros et passera plus vite dans la colonne que la protéine isolée

  5. Estimation de la taille de ce complexe
• Chromatographie d’affinité


  Co - immunoprécipitation
• Séparation de ces protéines

  Gel 1D, 2D (dénaturant, de type SDS-PAGE)
• Identification des protéines


  1. Western blot

  2. Microséquençage (EDMAN)

  3. Digestion trypsique / Spectroscopie de Masse
• FRET (Förster / Fluorescence Resonance Energy Transfer)


  Double-hybride
• FRET (Förster / Fluorescence Resonance Energy Transfer)


  Non-radiative process where energy from an excited donor fluorophore is transferred to an acceptor fluorophore in close proximity (distance < 10 nm)
• FRET Conditions


  • Excitation of the donor
  • Overlap of the donor's emission spectrum and the acceptor's absorption spectrum
  • Favorable donor/acceptor orientation
  • Distance between donor/acceptor < 10 nm (10-100 Angstroms)
• Detection of molecular interactions through FRET
• The distance at which the transfer is 50% efficient is called the Förster distance and varies depending on the fluorescent agents used (here: 50A°)
• Conformational change, Dimerization/interaction
• Allows to know where and when the molecules of interest act in the cell
• These interactions can be monitored in real-time with a camera attached to the fluorescence microscope
• Definition of structurally independent domains
• Kd, Kon, stoichiometry of the interaction, determination of buffer parameters
• Surface Plasmon Resonance (SPR) - BIACore

  1. Measures any biological interaction in real-time without labeling molecules

  2. Visualizes the kinetics of the interaction on the screen

  3. Measures association and dissociation rates and provides access to the dissociation constant (Kd)

  4. Records the modification of resonance induced by any molecular interaction continuously on a reactive lamella surface ("sensor chip")
• Chromatographie sur couche mince

  Migration de la phase mobile organique par capillarité sur un support poreux hydrophile
• Chromatographie sur couche mince

  Plus les molécules sont hydrophobes, plus elles se laissent entraîner par la phase mobile
• Fixation d’anticorps sur une matrice solide


  Pour récupérer les protéines reconnues par l'anticorps
• Fixation d’ADN spécifique


  Pour récupérer les protéines liant l'ADN