Mikroteknik

• Metode Irisan


  Suatu metode pembuatan sediaan dengan cara membuat irisan dengan tebal tertentu (6 µ) sehingga dapat diamati di bawah mikroskop
• Macam mikrotom


  • Mikrotom geser (sliding mikrotom)
  • Mikrotom putar (rotary mikrotom)
• Metode irisan


  • Metode beku
  • Metode Celoidin
  • Metode Parafin
• Metode Beku


  • Proses cepat, jaringan sedikit mengkerut, hampir semua metode pewarnaan dapat dikerjakan
  • Sangat sulit mendapatkan irisan yang tipis, sulit mendapatkan irisan yang seri
• Metode Celoidin


  • Kerutan hanya sedikit, jaringan yang besar dapat dipotong dengan baik
  • Proses lama, tidak mendapatkan irisan yang tipis
• Metode Parafin


  • Irisan jauh lebih tipis, irisan yang bersifat seri bisa didapat, proses jauh lebih cepat
  • Jaringan sedikit mengkerut, jaringan yang besar harus dipotong, sebagian enzim akan larut
• Hasil potongan yang baik

  • Tidak melipat
  • Tipis
  • Tidak robek
  • Orientasi benar
• Jenis potongan


  • Longitudinal section/Membujur
  • Cross section/Melintang
• Metode irisan


  • Metode Parafin
• Metode pewarnaan


  • Hematoksilin Eosin (HE)
  • Histokimia
  • Imunohistokimia
• Hematoksilin Eosin (HE)


  Pewarnaan umum untuk gambaran mikromorfologi jaringan
• Histokimia


  Pewarnaan khusus untuk mendeteksi bahan-bahan khusus (protein, karbohidrat)
• Imunohistokimia


  Pewarnaan khusus untuk mendeteksi protein tertentu menggunakan antibodi primer dan sekunder
• Tahapan metode imunohistokimia


  • Rehidrasi
  • Blocking dengan serum kambing
  • Inkubasi dengan antibodi primer
  • Inkubasi dengan antibodi sekunder
  • Visualisasi dengan DAB
  • Counterstain dengan hematoksilin
  • Dehidrasi dan mounting
• Penggolongan pewarna


  • Pewarna umum (Metode baku)
  • Pewarna khusus (Metode modern)
• Hematoksilin Eosin


  Pewarnaan umum untuk gambaran mikromorfologi jaringan, dengan hematoksilin mewarnai inti sel biru keunguan dan eosin mewarnai sitoplasma merah muda
• Persiapan alat dan bahan


  • Jar
  • Oven/incubator
  • Hotplate
  • Mikrotom
  • Larutan fiksatif
  • Alkohol bertingkat
  • Hematoksilin
  • Eosin
  • Xilol
  • Toluol
  • Parafin
• Tahapan metode parafin


  • Pengambilan jaringan
  • Fiksasi
  • Washing
  • Dehidrasi
  • Dealkoholisasi/Clearing/Penjernihan
  • Infiltrasi parafin
  • Embedding/Penanaman
• Tujuan fiksasi adalah untuk mempertahankan dan mengawetkan jaringan seperti kondisi saat hidup, menghentikan aktivitas enzimatik dan metabolisme
• Fiksasi dilakukan dengan merendam jaringan dalam larutan kimia (fiksatif) dengan pemanasan
• Fiksasi


  Untuk mengawetkan jaringan seperti kondisi saat hidup (elemen sel/jar. tetap pd tempatnya & tidak mengalami perubahan bentuk/ukuran)
• Fiksatif


  • Sebagian besar racun enzim
  • Merendam jaringan dalam larutan kimia (fiksatif), dengan pemanasan
• Proses pengawetan


  1. Bouin's

  2. Suhu

  3. Perlakuan fisik

  4. Fiksator

  5. Perlakuan kimia
• Proses pengawetan


  1. Formalin 10%

  2. Washing

  3. Dehidrasi

  4. Dealkoholisasi/Clearing/Penjernihan

  5. Infiltrasi Parafin

  6. Embedding / Penanaman

  7. Sectioning/Pemotongan

  8. Affixing/Penempelan

  9. Staining/Pewarnaan
• Dehidrasi


  Mengambil/menarik keluar ethanol yang terkandung dalam jaringan sesudah dehidrasi
• Embedding / Penanaman


  Mengganti bahan penjernihan dalam jaringan dengan parafin cair disertai pengerasan sehingga jaringan mudah dipotong menjadi irisan – irisan yang sangat tipis
• Orientasi jaringan


  • Cross section
  • Longitudinal section
• Sectioning/Pemotongan


  Jaringan yang terdapat dalam balok parafin dipotong dengan alat potong mekanis (mikrotom), menjadi irisan-irisan yang sangat tipis
• Affixing/Penempelan


  Irisan-irisan ditempelkan pada kaca obyek yang telah diolesi dengan mounting media sebagai perekat misalnya albumin-gliserin, kemudian dikeringkan pada suhu 2° - 5°C di bawah titik lebur parafin
• Pewarnaan Preparat Mikroanatomi dengan metode paraffin

  1. Deparafinisasi

  2. Staining

  3. Dehidrasi
• Membuat alkohol 50% sebanyak 100 ml


  1. V1 . M1 = V2 . M2

  2. x . 70% = 100 ml . 50%

  3. x = 5000 ml/70 = 71,43 ml Alkohol 70%

  4. Akuades = 100 - 71,43 = 28,57 ml
• Membuat alkohol 80% sebanyak 100 ml


  1. V1 . M1 = V2 . M2

  2. x . 95% = 100 ml . 80%

  3. x = 8000 ml/95 = 84,21 ml Alkohol 95%

  4. Akuades = 100 - 84,21 = 15,79 ml
• Kalibrasi Mikrometer


  1. Micrometer okuler diletakkan pada perangkat lensa okuler dan dicari bayangan skalanya

  2. Micrometer objektif diletakkan di meja objektif dan dicari bayangan skalanya

  3. Micrometer okuler diletakkan kembali pada perangkat lensa okuler dengan perbesaran 40x10

  4. Skala pada ujung kiri dari kedua micrometer, diusahakan saling sejajar, lalu dicari skala terdekat lainnya, dimana skala pada kedua micrometer berhimpitan untuk pertama kalinya

  5. Banyaknya anak skala pada micrometer objektif yang terdapat diantara 2 skala micrometer okuler yang sejajar dihitung dan nilai kalibrasi micrometer okuler dihitung

  6. Garis skala micrometer objektif ditempatkan tepat di bidang pendang

  7. Dihitung jumlah skala micrometer objektif yang menempati diameter bidang pandang dan kalikan dengan 0,01 mm untuk memperoleh panjang diameter bidang pandang

  8. Dihitung juga luas bidang pandang (LBP) dengan rumus ¼ µ x d2

  9. Micrometer okuler dikalibrasi terlebih dahulu dengan mirkometer objektif

  10. Preparat awetan diletakkan dibawah lensa objektif dan pada lensa okuler disisipkan mikrometr okuler

  11. Pada perbesaran yang telah dipilih, ditentukan 3 bidang pandang secara acak

  12. Diukur diameter setiap bidang pandang yang dipilih

  13. Dikalikan hasilnya dengan hasil kalibrasi micrometer okuler

  14. Dari ke-3 pengukuran diambil nilai rata-rata

  15. Diameter pada setiap bidang pandang dinyatakan dalam d1, d2, dan d3 dan dirata-ratakan

  16. Hitung standar deviasi

  17. Hitung galat

  18. Kisaran diameter preparat ditentukan dengan rata-rata diameter preparat ± galat
• Metode Supravital Staining (Mukosa Mulut)


  1. Diambil jaringan selaput lendir mulut dengan menggunakan stik eskrim dan dioleskan di atas object glass

  2. Ditetesi dengan larutan methylen blue

  3. Diamati dibawah mikroskop

  4. Untuk penyimpanan, preparat ditetesi dengan canada balsam/entelan lalu ditutup dengan cover glass
• Metode Apusan Darah (Smear Preparation)


  1. Diambil darah probandus (pria/wanita) dengan menggunakan autoklik, kemudian darah diteteskan di atas gelas benda

  2. Dibuat apusan darah dengan menggunakan objek glass dengan sudut 45°

  3. Dikeringanginkan preparat kemudian difixir dengan methanol selama 5 menit

  4. Diwarnai dengan menggunakan metode giemsa 2 % (diberi 2-3 tetes dan dibiarkan selama 45 menit – 2 jam)

  5. Dicuci dengan menggunakan air mengalir lalu dikeringanginkan

  6. Diamati dibawah mikroskop

  7. Untuk penyimpanan, preparat ditetesi dengan canada balsam/entelan lalu ditutup dengan cover glass

  8. Dikeringanginkan preparat kemudian ditetesi dengan pewarna wright selama 3-5 menit hingga menutupi semua bagian

  9. Ditetesi dengan larutan buffer fosfat pH 6.4 selama 15-20 menit

  10. Dicuci dengan menggunakan air mengalir (aquades) lalu dikeringanginkan

  11. Diamati dibawah mikroskop

  12. Untuk penyimpanan, preparat ditetesi dengan canada balsam/entelan lalu ditutup dengan cover glass
• Pembuatan Preparat Awetan Spora Tumbuhan Paku

  1. Dilakukan pengoleksian tumbuhan paku yang memiliki spora (spora yang sudah matang)

  2. Diambil spora dari tumbuhan paku, kemudian diletakkan di dalam cawan petri

  3. Ditambahkan alkohol 70% sampai spora terendam, kemudian dishaker selama 30 menit

  4. Disiapkan object glass kemudian ditetesi dengan spora yang sudah dishaker dengan alkohol 70%

  5. Ditutup dengan cover glass yang telah diolesi canada balsam

  6. Diberi kertas label dan diamati di bawah mikroskop

  7. Diambil gambar spora yang diamati dengan menggunakan camera digital

  8. Dibuat herbarium dari tumbuhan paku yang dikoleksi
• Whole Mount Embrio Ayam

  1. Diinkubasi telur ayam dalam incubator selama 24-48 jam (suhu 39-40°C)

  2. Diteropong telur dengan alat peneropong telur

  3. Ditandai dengan pensil tempat embrio yang akan dikupas

  4. Disiapkan bejana berisi larutan NaCl 0,9% hangat

  5. Dimasukan telur ke dalam bejana hingga tenggelam

  6. Ditusuk bagian tumpul telur (rongga udara pada telur) sampai gelembung udara di dalam telur dapat keluar

  7. Digunting bagian telur yang telah ditandai pensil dengan menggunakan gunting bedah dan dibuka bagian tersebut

  8. Digunting membran vitelin telur dengan menggunakan gunting

  9. Ditarik/diangkat blastoderm dengan pinset

  10. Diletakan blastoderm di atas kaca arloji yang telah berisi larutan NaCl 0,9%, direntangkan perlahan

  11. Dilekatkan pada kertas saring berbentuk lingkaran yang telah dilubangi bagian tengahnya

  12. Di fiksasi dengan larutan bouin selama 30-60 menit (tergantung ukuran embrio)

  13. Dicuci dengan etanol (alcohol 70%) sampai warna kuning berkurang

  14. Dilakukan proses pewarnaan dengan pewarnaan HE

  15. Di dehidrasi dalam etanol (60, 50, 40, 30%) dan akuades masing-masing 5 menit

  16. Di rendam dalam pewarna HE selama 10-20 detik

  17. Di cuci dengan air mengalir selama 10 menit

  18. Didehidrasi kembali dalam akuades alcohol (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96% dan absolut) masing-masing 5 menit

  19. Di clearing dengan toluol selama 10 menit

  20. Di rendam dalam xylol minimal 30
• Pembuatan preparat dengan metode parafin hewan

  1. Digunting bagian telur yang telah ditandai pensil dengan menggunakan gunting bedah dan dibuka bagian tersebut

  2. Digunting membran vitelin telur dengan menggunakan gunting

  3. Ditarik/diangkat blastoderm dengan pinset

  4. Diletakan blastoderm di atas kaca arloji yang telah berisi larutan NaCl 0,9%, direntangkan perlahan

  5. Dilekatkan pada kertas saring berbentuk lingkaran yang telah dilubangi bagian tengahnya

  6. Di fiksasi dengan larutan bouin selama 30-60 menit (tergantung ukuran embrio)

  7. Dicuci dengan etanol (alcohol 70%) sampai warna kuning berkurang

  8. Dilakukan proses pewarnaan dengan pewarnaan HE

  9. Di dehidrasi dalam etanol (60, 50, 40, 30%) dan akuades masing-masing 5 menit

  10. Di rendam dalam pewarna HE selama 10-20 detik

  11. Di cuci dengan air mengalir selama 10 menit

  12. Didehidrasi kembali dalam akuades alcohol (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96% dan absolut) masing-masing 5 menit

  13. Di clearing dengan toluol selama 10 menit

  14. Di rendam dalam xylol minimal 30 menit

  15. Di mounting menggunakan Canada balsam
• Alat


  • Dissecting set
  • Botol film
  • Botol durham
  • Shaker
  • Oven
  • Bekker glass
  • Pinset
  • Kaset parafin
  • Cetakan besi
  • Mikrotom
  • Kertas karbon
  • Kuas
  • Object glass
  • Cover glass
  • Pipet tetes
  • Pipet volume
  • Cutton bud
  • Hot plate
  • Gelas kaca
  • Staining jar
  • Kertas label
  • Tissue
  • Mikroskop
  • Kamera digital
  • Alat tulis
  • Alumunium foil
  • Tissue-tek DRS
• Bahan


  • Organ yang akan dipreparasi (mis: cor, intestinum, hepar, ventriculus, pulmo, testis, ren, dll)
  • Larutan bouin (As.Pikrat 70 ml + As.Asetat glacial 5 ml + formalin 40% 25ml)
  • Formalin 10%
  • Alkohol 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol absolute
  • Larutan xylol
  • Larutan toluol
  • Paraffin
  • Pewarnaan eosin (eosin 0,5 gram + alkohol 70% 100ml)
  • Pewarnaan hematoxilin (hematoxilin 0,67 gram + alkohol absolute 33ml + aquades 33ml + glycerol 33ml + asam asetat glacial 3,3ml)
  • Aquades
  • Canada balsam
  • Meyer albumin (albumin (putih telur) + glycerin (1:1))